李 鵬，王皓玉，畢文姬，夏侯秋錦，柏澤新，國(guó) 菲

（1.淄博市公安局刑偵支隊(duì)，山東 淄博 255000；2.太原市公安局刑偵支隊(duì)，山西 太原 030001）

氧化樂(lè)果（omethoate，OME），又稱(chēng)氧樂(lè)果，是有機(jī)磷農(nóng)藥的一種，能經(jīng)皮膚、呼吸道、消化道進(jìn)入體內(nèi)，抑制膽堿酯酶活性，使乙酰膽堿在組織內(nèi)蓄積而引起中毒，多見(jiàn)于經(jīng)口服中毒[1-3]。在氧化樂(lè)果中毒案件中，由于送檢不及時(shí)或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)部因素往往會(huì)使檢材不能及時(shí)進(jìn)行檢驗(yàn)。同時(shí)，由于案件的需要，常常要求對(duì)所送檢材進(jìn)行再次檢驗(yàn)或多次檢驗(yàn)從而確定是否為氧化樂(lè)果中毒死亡。毒物會(huì)發(fā)生分解，需對(duì)保存檢材中分解動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，明確保存檢材中毒（藥）物的檢出時(shí)限、最佳存儲(chǔ)條件，對(duì)于推斷中毒（死亡）當(dāng)時(shí)或檢材采取當(dāng)時(shí)體內(nèi)或檢材內(nèi)的毒（藥）物濃度意義重大[4]。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)氧化樂(lè)果的研究報(bào)道主要集中在中毒情況、中毒治療以及檢測(cè)方法的研究[5-7]，而關(guān)于氧化樂(lè)果的分解動(dòng)力學(xué)研究?jī)H見(jiàn)一篇報(bào)道[8]，并且為單一濃度氧化樂(lè)果在犬血中的研究，沒(méi)有系統(tǒng)全面地分析不同濃度氧化樂(lè)果在人血中的分解動(dòng)力學(xué)規(guī)律。本研究通過(guò)檢測(cè)人血中5種不同濃度的氧化樂(lè)果在-20℃、4℃、20℃三種保存條件下的含量變化，更系統(tǒng)、全面地研究氧化樂(lè)果在人血檢材中的分解動(dòng)力學(xué)規(guī)律，為氧化樂(lè)果中毒（死亡）案件的法醫(yī)學(xué)鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

4000Q TRAP液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)AB公司），CF16RN落地式多功能離心機(jī)（日本日立公司），HY-5渦旋振蕩器（常州恒睿儀器設(shè)備制造有限公司），移液器（德國(guó)Eppendorf公司）。

氧化樂(lè)果標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于公安部物證鑒定中心，甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑均為色譜純，試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 樣本處理

于1 mL血樣中加入2 mL乙腈，渦旋振蕩5 min，再以離心半徑6 cm，12 000 r/min，高速離心7 min，取上清液過(guò)0.22μm濾膜，待分析。

1.2.2 分析條件

色譜柱為ACQUITY UPLCTMBEH C18柱（2.1mm×50mm，1.7μm，美國(guó)Waters公司），流速為0.3mL/min，進(jìn)樣量為2 μL，流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨水溶液，流動(dòng)相B為甲醇。流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序 （%）

質(zhì)譜條件：電噴霧離子（electrospray ionization，ESI）源，正離子掃描，檢測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；碰撞氣為氮?dú)?；氣簾氣（CUR）為20 psi，噴撞氣（CAD）為Medium，離子化電壓（IS）為5 500 V，溫度（TEM）為500℃，噴霧氣（GS1）為50 psi，輔助加熱氣（GS2）為50psi，接口加熱為on，碰撞室入口電壓（EP）為10V，碰撞室出口電壓（CXP）為6V；保留時(shí)間為1.0min；氧化樂(lè)果去簇電壓為66eV，定性離子對(duì)m/z214.0/155.1的碰撞電壓為21 eV，m/z214.0/183.1的碰撞電壓為24eV，其中m/z214.0/155.1為定量離子對(duì)。

1.3 方法學(xué)驗(yàn)證

1.3.1 工作曲線和檢出限

取空白全血分別添加氧化樂(lè)果標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為 0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、7.50μg/mL，按1.2節(jié)方法操作，以氧化樂(lè)果質(zhì)量濃度為自變量（x）、峰面積為因變量（y）繪制工作曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)，并將信噪比（S/N）＞3的質(zhì)量濃度作為檢出限，10倍的檢出限作為定量限。

1.3.2 基質(zhì)效應(yīng)、回收率及精密度

精密吸取15份空白全血1mL，按1.2.1節(jié)方法進(jìn)行處理，將提取液分為3組，每組分別添加氧化樂(lè)果標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0.2、0.5、1.0μg/mL進(jìn)行測(cè)定，以測(cè)得的基質(zhì)提取后添加樣品中目標(biāo)物的峰面積與相同質(zhì)量濃度對(duì)照品的峰面積比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。

精密吸取15份空白全血1mL，分為3組，每組分別添加氧化樂(lè)果標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0.2、0.5、1.0μg/mL，按1.2節(jié)方法操作，以測(cè)得的血中氧化樂(lè)果的峰面積與相同質(zhì)量濃度對(duì)照品的峰面積比值計(jì)算回收率。

取質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1.0 μg/mL的添加樣品，每個(gè)濃度平行測(cè)定3份，在同一天內(nèi)早、中、晚分別按1.2節(jié)方法進(jìn)行分析檢測(cè)，計(jì)算目標(biāo)物峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），得到日內(nèi)精密度，連續(xù)測(cè)3d，得到日間精密度。

1.4 分解動(dòng)力學(xué)模型制備與數(shù)據(jù)處理

取5份空白血液，分別添加氧化樂(lè)果至質(zhì)量濃度為0.78、1.40、2.30、4.50、7.20μg/mL（通過(guò)查詢(xún)山東省公安廳涉毒藥物毒物中毒死亡綜合研判系統(tǒng)，確定實(shí)驗(yàn)濃度）。將血樣分別置于-20℃（冰箱冷凍）、4℃（冰箱冷藏）、20℃（20℃空調(diào)房?jī)?nèi)）三種溫度環(huán)境中，在0、1、3、4、7、11、15、24、32、40、48、64、80、96和120d進(jìn)行檢測(cè)。

采用WinNonlin?v5.2藥代動(dòng)力學(xué)軟件處理保存血液的平均藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 色譜圖及質(zhì)譜圖

空白血液及添加氧化樂(lè)果血樣的液質(zhì)聯(lián)用儀色譜圖如圖1所示。結(jié)果顯示，在選擇的實(shí)驗(yàn)條件下，血液中的雜質(zhì)不影響氧化樂(lè)果的測(cè)定。

圖1 空白血液及添加氧化樂(lè)果血樣的色譜圖

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性范圍和檢出限

全血添加氧化樂(lè)果標(biāo)準(zhǔn)品的線性方程為y=7.3×105x+2200，相關(guān)系數(shù)（r）為0.9988，線性范圍為0.02～7.50μg/mL，檢出限為0.002μg/mL。

2.2.2 基質(zhì)效應(yīng)、回收率及精密度

不同質(zhì)量濃度氧化樂(lè)果的基質(zhì)效應(yīng)、回收率及精密度見(jiàn)表2。

表2 氧化樂(lè)果基質(zhì)效應(yīng)、回收率及精密度 （%）

2.3 氧化樂(lè)果在不同溫度下保存的含量變化

在-20℃和4℃條件下質(zhì)量濃度為0.78、1.40、2.30、4.50、7.20μg/mL的氧化樂(lè)果在120d時(shí)，含量分別下降至初始質(zhì)量濃度的30.77%、37.14%、50.87%、72.00%、67.36%和5.13%、3.57%、5.22%、12.89%、13.06%，而20℃條件下，32d后就很難檢測(cè)到。血液中5種質(zhì)量濃度的氧化樂(lè)果在不同溫度下的含量變化見(jiàn)表3。

WinNonlin?v5.2藥代動(dòng)力學(xué)軟件處理結(jié)果顯示：在-20℃、4℃和20℃條件下氧化樂(lè)果的分解均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程一室開(kāi)放模型，可以用Ct=Coe-αt表示（t表示時(shí)間，單位為d；Ct為時(shí)間t測(cè)得的含量；Co表示初始含量；α為分解速率常數(shù)；e為自然對(duì)數(shù)的底數(shù)），氧化樂(lè)果在不同溫度下的分解動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4。根據(jù)此方程計(jì)算所得的理論值與實(shí)測(cè)值接近，見(jiàn)表5～7。

表3 血中不同濃度氧化樂(lè)果在不同溫度下保存的質(zhì)量濃度變化 （n=2，μg·mL-1）

表4 氧化樂(lè)果在不同溫度下的分解動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表5 不同質(zhì)量濃度氧化樂(lè)果在-20℃條件下保存的理論值與實(shí)測(cè)值 （μg·mL-1）

表6 不同質(zhì)量濃度氧化樂(lè)果在4℃條件下保存的理論值與實(shí)測(cè)值 （μg·mL-1）

表7 不同質(zhì)量濃度氧化樂(lè)果在20℃條件下保存的理論值與實(shí)測(cè)值 （μg·mL-1）

3 討 論

有研究[9]表明，保存檢材中毒物的分解動(dòng)力學(xué)主要受保存條件的影響，包括溫度、時(shí)間、器皿類(lèi)型、防腐劑、pH值等。其中，溫度是影響保存生物檢材中毒物分解的主要因素之一，毒物在生物檢材中的分解速度與保存溫度相關(guān)。本研究結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的氧化樂(lè)果在-20℃、4℃、20℃保存條件下含量均呈下降趨勢(shì)，隨著溫度的升高，氧化樂(lè)果降解速度加快。可見(jiàn)，低溫保存可延緩氧化樂(lè)果的分解，溫度在20℃時(shí)，生物檢材腐敗最快，因而毒物代謝也較快，檢材被冷藏或冷凍保存時(shí)腐敗均較慢，分解亦較慢。這也提示日常工作中，由于各種原因?qū)е聶z材提取后無(wú)法立即送檢或檢驗(yàn)的，應(yīng)當(dāng)?shù)蜏乇４妗?20℃和4℃條件下，檢材中氧化樂(lè)果含量也均有下降，因此在低溫條件下保存的氧化樂(lè)果檢材也應(yīng)盡快送檢、檢驗(yàn)，以免長(zhǎng)時(shí)間保存造成氧化樂(lè)果分解而無(wú)法檢測(cè)。

本研究結(jié)果顯示，用所擬合的公式Ct=Coe-αt和參數(shù)計(jì)算所得血液中氧化樂(lè)果的理論值與實(shí)測(cè)值接近，說(shuō)明應(yīng)用血液中毒物分解動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型和參數(shù)可以模擬生物檢材中氧化樂(lè)果含量隨時(shí)間的變化，估算檢材在保存期間某一時(shí)間點(diǎn)的毒物濃度。同時(shí)，在20℃保存條件下不同質(zhì)量濃度氧化樂(lè)果的分解速率常數(shù)α取平均值0.092，分解動(dòng)力學(xué)方程為Ct=Coe-0.092t，半衰期為7.5 d。在4℃及-20℃保存條件下，將分解速率常數(shù)α分為低質(zhì)量濃度（小于4μg/mL）的分解速率常數(shù)α和高質(zhì)量濃度（大于4μg/mL）的分解速率常數(shù)α。在-20℃保存條件下，低質(zhì)量濃度分解速率常數(shù)α平均值為0.007，分解動(dòng)力學(xué)方程為Ct=Coe-0.007t，半衰期為99 d；高質(zhì)量濃度分解速率常數(shù)α平均值為0.003，分解動(dòng)力學(xué)方程為Ct=Coe-0.003t，半衰期為231d。在4℃保存條件下，低質(zhì)量濃度分解速率常數(shù)α平均值為0.025，分解動(dòng)力學(xué)方程為Ct=Coe-0.025t，半衰期為27.7 d；高質(zhì)量濃度分解速率常數(shù)α平均值為0.017，分解動(dòng)力學(xué)方程為Ct=Coe-0.017t，半衰期為40.8d。在氧化樂(lè)果中毒（死亡）案件的法醫(yī)學(xué)鑒定中，可根據(jù)實(shí)際情況，運(yùn)用適合的分解動(dòng)力學(xué)方程和參數(shù)來(lái)推斷檢材提取當(dāng)時(shí)或中毒死亡當(dāng)時(shí)的毒物質(zhì)量濃度，正確分析和使用毒物分析結(jié)果，為氧化樂(lè)果中毒（死亡）案件的法醫(yī)學(xué)鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

綜上所述，氧化樂(lè)果在保存血液中不穩(wěn)定，分解很快，低溫保存可以減緩其分解，分解動(dòng)力學(xué)過(guò)程可用一級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程一室開(kāi)放模型來(lái)描述。氧化樂(lè)果中毒（死亡）案件的法醫(yī)學(xué)鑒定中，檢材應(yīng)低溫冷凍保存，立即送檢并檢驗(yàn)。如果檢材保存時(shí)間較長(zhǎng)，可用其分解動(dòng)力學(xué)方程和參數(shù)估算檢材提取或送檢當(dāng)時(shí)的氧化樂(lè)果濃度。