孫小龍 ，陳 耀 ，付永前 ，

（1.臺州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 臺州 318000；2.浙江金晟環(huán)保股份有限公司，浙江 臺州 317300）

0 引言

L-乳酸作為生產(chǎn)綠色環(huán)保原料乳酸乙酯以及生物降解塑料-聚乳酸的單體，而越來越引起人們的重視［1］。合成L-乳酸的方法有很多，主要有化學(xué)合成法、酶法生產(chǎn)以及發(fā)酵法生產(chǎn)［2-4］。其中根霉菌，尤其是米根霉，因其在發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸過程中具有自身獨(dú)特的優(yōu)勢：高效、安全、環(huán)保等，而越來越多的應(yīng)用于L-乳酸的合成研究中［5，6］。目前米根霉合成L-乳酸由于較低的生產(chǎn)效率而難以應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)［7，8］，為了提高米根霉合成L-乳酸的生產(chǎn)效率，大量工作致力于高產(chǎn)菌株的篩選、菌體形態(tài)控制、利用低價(jià)的原料以及新型生物反應(yīng)器等的研究［4，9-11］。然而，在絕大多數(shù)利用米根霉發(fā)酵合成L-乳酸的研究中，乳酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率多數(shù)在60-120.0 g/L和0.7-2.5 g/L/h之間，遠(yuǎn)低于乳酸菌的生產(chǎn)效率［8，12，13］。部分研究嘗試通過菌絲球或固定化細(xì)胞方法達(dá)到令人滿意的生產(chǎn)水平［14，15］，如，Efremenko等［14］提出，利用PVA凝膠固定化細(xì)胞可最大化的提高米根霉發(fā)酵產(chǎn)乳酸的生產(chǎn)效率，但是，這種搖瓶培養(yǎng)技術(shù)并不適用大規(guī)模的 L-乳酸生產(chǎn)［8，12］。

為了提高米根霉合成乳酸的生產(chǎn)效率，本課題組創(chuàng)新性的提出了米根霉一步發(fā)酵高通量合成L-乳酸的策略［7］，在該策略條件下，米根霉發(fā)酵階段L-乳酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率分別達(dá)到了158.0 g/L和5.54 g/（L·h）。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，分批補(bǔ)料策略有利于米根霉一步發(fā)酵合成L-乳酸。目前，基本沒有文獻(xiàn)系統(tǒng)研究分批補(bǔ)料調(diào)控對米根霉一步發(fā)酵合成L-乳酸的影響。因此，本研究，將系統(tǒng)的研究米根霉一步發(fā)酵積累L-乳酸的體系下的分批補(bǔ)料調(diào)控策略，為米根霉高效積累L-乳酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 菌種

米根霉（Rhizopus oryzae）LA-UN-1（NRRL 395誘變菌株），臺州學(xué)院生物質(zhì)資源研究所保藏［8］。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

葡萄糖（分析純），磷酸二氫鉀，氯化鉀，氯化鈣，碳酸鈣，均采購于廣東汕頭市西隴化工廠，瓊脂，蛋白胨，尿素，硫酸銨，酵母膏，磷酸均由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材

恒溫振蕩器（太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠），SBA-40C生物傳感儀（山東微生物研究院），7.5L發(fā)酵罐（New Brunswick Scientific co.，bioflo 110系列），電子天平（賽多利斯），HPLC（戴安系列 Summit P 680）。

1.4 培養(yǎng)基

一步發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20.0-220.0（根據(jù)不同分批補(bǔ)料策略進(jìn)行初糖濃度控制）；蛋白胨3.0；KH2PO40.2；MgSO4·7H2O 0.2；CaCO3過量。

1.5 培養(yǎng)方法

1.5.1 米根霉孢子懸浮液的制備

取米根霉菌絲體接種于PDA斜面培養(yǎng)基，隨后置于恒溫培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)6-7 d，孢子成熟后用無菌水洗下孢子，用醫(yī)用無菌棉過濾得到孢子懸浮液。采用血球板計(jì)數(shù)法調(diào)整孢子濃度為107個(gè)/mL，保藏于4℃的冰箱待用。

1.5.2 一步乳酸發(fā)酵培養(yǎng)［7］

在優(yōu)化的7.5 L發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行，工作體積為5.0 L，取濃度為107個(gè)孢子/mL的孢子液100 mL接入到發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。一步發(fā)酵24 h進(jìn)入產(chǎn)酸階段，通過減少發(fā)酵罐中發(fā)酵液體積（減少到原體積的50%）來增加單位菌體生物量［7］，從而進(jìn)入快速產(chǎn)酸階段。整個(gè)過程中通氣量、攪拌速度，培養(yǎng)溫度分別控制在0.5 vvm、300 rpm和30℃，碳酸鈣作為中和劑。以單批次，初始濃度為220 g/L的葡萄糖作為對照。在整個(gè)發(fā)酵過程中，不再添加葡萄糖，除了過量的CaCO3作為中和劑調(diào)節(jié)pH值在6.0左右。

所有的分批補(bǔ)料發(fā)酵（初始葡萄糖濃度分別為150.0，100.0，50.0和20.0 g/L）都是以單批次培養(yǎng)開始，在發(fā)酵過程中，當(dāng)殘?zhí)墙档?.0 g/L以下時(shí)，用濃度為400 g/L的葡萄糖母液進(jìn)行調(diào)節(jié)。過量的CaCO3作為中和劑調(diào)節(jié)pH值在6.0左右。

1.6 分析方法

在樣品5.0 mL中加入5.0 mL的1 mol/L的鹽酸溶液，將混合液置于80℃的恒溫水浴鍋中至反應(yīng)10 min，5000 rpm離心5 min后，取清液稀釋定容至所需體積，用0.45 μm微濾膜抽濾清液，待用。

糖濃度的測定：SBA-40C生物傳感分析儀測定。

細(xì)胞干重的測定：將培養(yǎng)物抽濾，并用蒸餾水洗滌3次，抽濾后，60℃烘干至恒重（含水量在4%以下），稱重。

乳酸的測定：按文獻(xiàn)［8］方法進(jìn)行。HDLC檢測方法：進(jìn)樣量20 uL；流動(dòng)相0.005 M H2SO4，流速0.8 mL/min；溫度 60℃。

1.7 動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算［7］

L-乳酸比生成速率（qp，h-1）通過方程式（1）來估計(jì)或擬合細(xì)胞生長（x，g/L）和 L-乳酸生產(chǎn)量（p，g/L）的數(shù)據(jù)擬合數(shù)據(jù)將用Origin繪圖軟件對分批發(fā)酵過程中的數(shù)據(jù)進(jìn)行插值計(jì)算（時(shí)間間隔為0.1 h）得到。

1.8 LDH（乳酸脫氫酶）酶活測定

按文獻(xiàn)［9］方法進(jìn)行。每分鐘催化1μmol/L NADH的酶量為一個(gè)酶活單位。蛋白濃度使用Bradford方法檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 單批次和分批補(bǔ)料對米根霉一步發(fā)酵合成L-乳酸的影響

在之前的研究中［7］，當(dāng)總葡萄糖濃度達(dá)到220.0 g/L時(shí)，L-乳酸積累被強(qiáng)烈的抑制。因此，在這里，初始葡萄糖濃度為220.0 g/L的單批次發(fā)酵和不同初始葡萄糖濃度（150.0，100.0，50.0和20.0 g/L）但總糖濃度控制在220.0 g/L左右的分批補(bǔ)料發(fā)酵對米根霉一步發(fā)酵合成L-乳酸的影響進(jìn)行了考察，其結(jié)果如圖1所示。從圖1A-E和表1所示，L-乳酸的合成不管是在單批次發(fā)酵還是分批補(bǔ)料發(fā)酵，都存在兩個(gè)比較明顯的階段（這與之前研究［7］基本一致）。與單批次乳酸發(fā)酵相比，分批補(bǔ)料發(fā)酵不管是最后L-乳酸的產(chǎn)量，生產(chǎn)效率還是菌體生物量，都明顯高于單批次發(fā)酵（單批次發(fā)酵在發(fā)酵階段的乳酸產(chǎn)量、生產(chǎn)效率和菌體量僅僅只有101.0 g/L，2.52 g/（L·h）和6.85 g/L）。這也進(jìn)一步驗(yàn)證了單批次發(fā)酵中細(xì)胞周邊較高的滲透壓不利于乳酸的合成［10］。

在分批補(bǔ)料發(fā)酵過程中，L-乳酸的產(chǎn)量，生產(chǎn)效率和糖酸轉(zhuǎn)化率隨著初始葡萄糖濃度的降低而增加（表1）。當(dāng)初始葡萄糖濃度達(dá)到50.0 g/L時(shí)，產(chǎn)酸階段的L-乳酸產(chǎn)量，生產(chǎn)效率以及糖酸轉(zhuǎn)化率都達(dá)到最大，分別為160.0 g/L，6.15 g/（L·h）和0.82 g/g。與單批次發(fā)酵相比，L-乳酸產(chǎn)量，生產(chǎn)效率以及糖酸轉(zhuǎn)化率分別提高了1.57，2.44和1.68倍。與此同時(shí)，該生產(chǎn)效率也要高于課題組之前的報(bào)道［7］（5.45 g/（L·h））。隨著初始葡萄糖濃度的進(jìn)一步降低，較低的初始葡萄糖濃度（20.0 g/L）并不有利于L-乳酸的積累，進(jìn)一步對發(fā)酵過程進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵初始階段，乳酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率相對較高，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行（達(dá)到37 h后），其葡萄糖消耗速率和乳酸生成速率開始下降，并逐漸低于其它分批補(bǔ)料調(diào)控方式。

為了更加深入的研究不同一步發(fā)酵策略對L-乳酸合成的影響，我們對L-乳酸比生成速率（qp）進(jìn)行分析。這些參數(shù)將基于圖1A-E中的數(shù)據(jù)，利用插值法進(jìn)行計(jì)算，最終結(jié)果可見圖1F。如圖所示，發(fā)酵培養(yǎng)24 h后，分批補(bǔ)料發(fā)酵的qp都要高于單批次發(fā)酵，qp隨著初始葡萄糖濃度的降低而增加，發(fā)酵培養(yǎng)37 h后，初始糖濃度為20.0 g/L的qp達(dá)到最高值隨后開始下降，與此同時(shí)，其他發(fā)酵模式下的qp繼續(xù)上升，并在培養(yǎng)43 h后達(dá)到最大。而此時(shí)始葡萄糖濃度為50.0 g/L時(shí)的qp最大。

圖1 米根霉單批次和分批補(bǔ)料一步發(fā)酵曲線（A）單批次發(fā)酵，初始葡萄糖為220.0g/L；（B）分批補(bǔ)料發(fā)酵：初始葡萄糖濃度150.0g/l，發(fā)酵進(jìn)行到47小時(shí)補(bǔ)糖70.0g/L，總糖為219.0g/L；（C）分批補(bǔ)料發(fā)酵：初始葡萄糖濃度100.0g/L，發(fā)酵進(jìn)行到37，34和47小時(shí)，分別補(bǔ)糖45.0g/L，總糖為224.0g/L；（D）分批補(bǔ)料發(fā)酵：初始葡萄糖濃度50.0g/L，發(fā)酵進(jìn)行到29，39和45小時(shí)，分別補(bǔ)糖60，60和55.0g/L，總糖為217.0g/L；（E）分批補(bǔ)料發(fā)酵：初始葡萄糖濃度20g/L，發(fā)酵進(jìn)行到24，32，39和47小時(shí)，分別補(bǔ)糖50.0g/L，總糖為218.0g/L；（F）乳酸比合成速率（qp）。（□）殘余葡萄糖濃度；（△）生物量；（○）L-乳酸。Fig．1 Time-course of L-LA production by R.oryzae one-step fermentation using batch and fed-batch culture strategies.（A）Batch culture with 220g/L initial glucose；（B）Fed-batch culture:Initial glucose concentration of 150g/L，with 70g/L of supplemental glucose fed in to the fermenter after 47h of fermentation，resulting in a total glucose concentration of 219 g/L；（C）Fed-batch culture（ Initial glucose concentration of 100g/L，with solutions of 45g/L glucose fed in to the fermenter at 37，43，and 47h，resulting in a total glucose concentration of 224g/L；（D）Fed-batch culture:Initial glucose concentration of 50 g/L，with two solutions of 60 g/L glucose added into the fermenter at 29 and 39h，and a solution of 55 g/L glucose added at 45h，resulting in a total glucose concentration of 217g/L；（E）Fed-batch culture:Initial glucose concentration 20/L，with 50g/L glucose added to the fermenter at 24，32，39 and 47h，resulting in a total glucose concentration of 218g/L；（F）Comparison of specific L-LA formation rate（qp）.（□）Residual glucose concentration；（△）Biomass；（○）L-LA production.

表1 不同一步發(fā)酵策略產(chǎn)乳酸參數(shù)對比Table．1 Comparisons of the parameters of L-LA one-step fermentation by R.oryzae using different culture strategies

在之前的研究中發(fā)現(xiàn)［8］，米根霉培養(yǎng)過程中的菌體生物量和菌球特性能影響L-乳酸的合成效率。在單批次發(fā)酵過程中（初始葡萄糖濃度為220.0 g/L），菌體培養(yǎng)24 h后，生物量較低（6.85 g/L），并且菌球光滑致密，該菌體形態(tài)不利于傳氧傳質(zhì)，并最終影響L-乳酸的合成［15，16］；在分批補(bǔ)料發(fā)酵過程中，隨著初始葡萄糖濃度的降低，菌體培養(yǎng)24 h后，生物量越來越大（分別為8.24，8.94和9.01 g/L），與此同時(shí)，形成的菌球越來越松散，松散的菌球有利于L-乳酸的合成；當(dāng)初始葡萄糖濃度為20.0 g/L時(shí)，菌體形態(tài)呈現(xiàn)于菌球與絮狀混合狀態(tài)，該形態(tài)在發(fā)酵培養(yǎng)前37 h，有利于傳氧傳質(zhì)，然而，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，該形態(tài)將進(jìn)一步增加發(fā)酵過程中溶液的黏稠度，從而進(jìn)一步增加了傳氧傳質(zhì)的阻力，并進(jìn)一步降低L-乳酸的合成［17-19］。

在此基礎(chǔ)上，對不同培養(yǎng)條件下，不同培養(yǎng)時(shí)間（24，36，43，50 h）的乳酸脫氫酶（LDH）酶活進(jìn)行了分析比對（表2）。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)24 h后，分批補(bǔ)料發(fā)酵的LDH都明顯高于單批次培養(yǎng)，與此同時(shí)，初始葡萄糖濃度為20.0 g/L的LDH最高，隨著初始葡萄糖濃度的增加而遞減，該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了較高的初始葡萄糖濃度會降低LDH活力和L-乳酸的積累［10，11］。初始濃度為20.0 g/L的LDH的酶活在發(fā)酵36 h后達(dá)到頂峰，而其他的初始葡萄糖濃度的LDH都是在43 h達(dá)到頂峰。與此同時(shí)，在此階段，L-乳酸的生產(chǎn)效率也達(dá)到最大，隨后，LDH酶活開始下降。研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵的所有階段，低初始葡萄糖濃度的LDH酶活要高于高初始葡萄糖濃度，LDH酶活的變化規(guī)律基本相同（除了20.0 g/L），20.0 g/L初始葡萄糖LDH酶活在發(fā)酵36小時(shí)后迅速下降。以上結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了20 g/L初始葡萄糖濃度發(fā)酵前期有利于乳酸的積累，但后期由于環(huán)境的變化而影響L-乳酸的合成。

表2 不同一步發(fā)酵策略LDH酶活變化Table．2 LDH-specific activity for L-LA production by R.oryzae one-step fermentation using different culture strategies

2.2 分批補(bǔ)料發(fā)酵不同殘?zhí)强刂颇Ｊ綄-乳酸合成的影響

分批補(bǔ)料一步發(fā)酵過程中，控制初始葡萄糖濃度為50.0 g/L，考察不同殘余葡萄糖濃度（0～60，0～30.0和30～60.0 g/L）控制方式對L-乳酸合成的影響，其結(jié)果見表1。如表1所示，當(dāng)初始葡萄糖濃度恒定時(shí)，不同殘余葡萄糖濃度的變化對L-乳酸的合成并未有明顯的變化，由于可知，采用分批補(bǔ)料一步發(fā)酵高通量積累L-乳酸，后期殘余葡萄糖濃度的變化，并不會對L-乳酸合成產(chǎn)生本質(zhì)的影響。

3 結(jié)論

考察了不同分批補(bǔ)料發(fā)酵策略（不同初始葡萄糖濃度以及殘余葡萄糖控制方式）對米根霉一步發(fā)酵合成L-乳酸的影響，并得到以下結(jié)論：

（1）分批補(bǔ)料發(fā)酵過程中，控制初始葡萄糖濃度在50.0 g/L時(shí)，得到了較高的L-乳酸產(chǎn)量（162.0 g/L）和生產(chǎn)效率（6.23 g/（L·h）），與前期工作相比，雖然L-乳酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率并未有較大變化，但生產(chǎn)效率提高了14.3%；

（2）不同初始葡萄糖濃度會影響菌體生物量和菌體形態(tài)，并最終影響L-乳酸的合成，初始葡萄糖濃度為50.0 g/L時(shí)，培養(yǎng)得到的菌體最有利于L-乳酸的合成。當(dāng)初始葡萄糖濃度過低時(shí)（20.0 g/L），雖然培養(yǎng)得到的菌體有利于前期L-乳酸的合成，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液越來越黏稠，而不利于傳氧傳質(zhì)，并最終影響后期的L-乳酸的合成；

（3）初始葡萄糖濃度對L-乳酸的合成影響較大，殘余葡萄糖濃度的調(diào)控，對米根霉分批補(bǔ)料發(fā)酵合成L-乳酸，并未有明顯的變化。

總體來講，分批補(bǔ)料策略，能提高米根霉一步發(fā)酵法合成L-乳酸的生產(chǎn)效率，是一種利用米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方便、經(jīng)濟(jì)的方法，該工藝的研究，將為傳統(tǒng)的絲狀真菌合成有機(jī)酸提供良好的思路。