魏曉晶 胡曉

[摘要] 外泌體是由細(xì)胞分泌的膜性囊泡，是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)，參與到細(xì)胞間生物信號(hào)的傳遞。目前有5種公認(rèn)且較為常用的提取外泌體的方法。外泌體在臨床疾病研究中突破性的進(jìn)展主要體現(xiàn)在外泌體參與腫瘤疾病的進(jìn)展、外泌體中的核酸或蛋白可以作為疾病的分子標(biāo)志物、外泌體可以作為藥物的載體進(jìn)行靶向治療等方面。外泌體在疾病中行使的功能使其極具向臨床應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)。本文主要從外泌體的發(fā)現(xiàn)、提取方法優(yōu)缺點(diǎn)及其在臨床疾病功能的研究進(jìn)展這三個(gè)方面加以闡述。

[關(guān)鍵詞] 外泌體；提取方法；外泌體與臨床疾病

[中圖分類號(hào)] R733 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）12（a）-0045-04

1983年，外泌體首次于綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[1-2]，1987年Johnstone等[3]將其命名為“exosome”。研究者最初認(rèn)為外泌體是一種實(shí)驗(yàn)的人工制品、廢物或死細(xì)胞的殘留物[1]。到20世紀(jì)90年代，Zitvogel等[4]和Raposo等[5]發(fā)現(xiàn)外泌體很可能是細(xì)胞間相互交流的一種新方式。2007年，Valadi等[6]發(fā)現(xiàn)外泌體內(nèi)攜帶有核酸（mRNA、microRNA等）和蛋白質(zhì)，并可以被其他細(xì)胞捕獲。這一系列的突破性發(fā)現(xiàn)打開了外泌體研究的新篇章。目前，外泌體提取方法各具特色，并能夠得到用于研究的外泌體，因此外泌體研究在近幾年呈現(xiàn)指數(shù)型上漲。外泌體在臨床疾病方面也有較多突破性的報(bào)道，這種納米級(jí)的小分子有希望替代細(xì)胞治療投入到臨床應(yīng)用之中。

1 外泌體定義與提取鑒定方法

外泌體是攜帶核酸和蛋白質(zhì)的直徑為30～150 nm的膜性囊泡，外泌體表面表達(dá)CD63、CD9、CD81等表面標(biāo)志物。胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）為細(xì)胞分泌的由膜包裹的囊泡統(tǒng)稱為胞外囊泡，其包括外泌體、外膜泡、微泡、微粒、凋亡小體和其他EV亞群。外泌體起源于質(zhì)膜循環(huán)途徑中的膜腔或早期胞內(nèi)體，這些膜腔或早期胞內(nèi)體向內(nèi)凹陷形成管腔內(nèi)膜泡，進(jìn)一步發(fā)展成為多泡小體，多泡小體在細(xì)胞內(nèi)分子馬達(dá)的牽引下與細(xì)胞表面融合，最終分泌出去[7]。基于外泌體的物理化學(xué)和生物化學(xué)性質(zhì)，已經(jīng)開發(fā)了許多用于分離外泌體的技術(shù)。

1.1 外泌體提取方法

外泌體提取方法可分為5類，分別是超速離心、超濾、免疫吸附、沉淀法、基于微流控的分離技術(shù)等[8-9]。這5種提取外泌體的方法所依據(jù)的原理以及其各自的優(yōu)缺點(diǎn)，見表1。

1.2 外泌體的鑒定

國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)（ISEV）[10]于2014年發(fā)布了研究和定義細(xì)胞外囊泡及其功能所需要的最少實(shí)驗(yàn)要求的指導(dǎo)性聲明文件。文中指出：對(duì)于外泌體的鑒定必須從形態(tài)、蛋白分子標(biāo)記、粒徑大小等三個(gè)方面進(jìn)行鑒定。

使用透射電鏡觀察外泌體形態(tài)特征和大小，在電鏡下呈現(xiàn)為杯子樣的形態(tài)。條件培養(yǎng)基經(jīng)過高速離心得到的外泌體直徑在30～150 nm[11]。動(dòng)態(tài)粒子跟蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）的方法可檢測(cè)顆粒的直徑大小和納米粒子的濃度[12-13]，它通過記錄在布朗運(yùn)動(dòng)下激光照射的單個(gè)粒子的運(yùn)動(dòng)，然后用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法計(jì)算顆粒直徑。外泌體攜帶有許多不同的蛋白標(biāo)記，如HSP70和CD81、CD9、CD63等[14]，因此可以使用磁珠增加外泌體的體積從而用流式分析檢測(cè)其表面標(biāo)志物，同樣可以使用Western blot檢測(cè)外泌體含有的蛋白標(biāo)記[15]。國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)規(guī)定了最少需要檢測(cè)的外泌體蛋白標(biāo)記，包括外泌體內(nèi)（TSG101等）和外泌體表面蛋白（CD63等）。

2 外泌體功能研究進(jìn)展

基于外泌體參與細(xì)胞間交流的功能，外泌體內(nèi)攜帶的核酸/蛋白可以參與疾病的進(jìn)展，可以作為疾病診斷的分子標(biāo)記，同樣也可作為藥物載體靶向特定疾病部位。

2.1 參與細(xì)胞與細(xì)胞間的交流

外泌體作為細(xì)胞間信息交流的載體，將其所攜帶的核酸和蛋白傳遞到受體細(xì)胞內(nèi)并影響受體細(xì)胞的功能。在生理?xiàng)l件下，細(xì)胞通過分泌外泌體介導(dǎo)細(xì)胞間信息的傳遞，間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體和微泡以劑量依賴性方式抑制T淋巴細(xì)胞增殖并降低CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群的比例，外泌體增加了Treg細(xì)胞群的數(shù)量[16]。樹突細(xì)胞分泌的外泌體能夠募集間充質(zhì)干細(xì)胞，提高間充質(zhì)干細(xì)胞向損傷部位的遷移能力，從而促進(jìn)損傷局部的修復(fù)[17-18]。在病理?xiàng)l件下，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體通過與骨髓內(nèi)造血祖細(xì)胞的相互作用，或者是腫瘤細(xì)胞直接與淋巴結(jié)相互作用，又或者是通過與周圍成纖維細(xì)胞的相互作用，從而增加腫瘤細(xì)胞的遷移能力。Luga等[19]報(bào)道成纖維細(xì)胞分泌的外泌體通過Wnt-PCP信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞（BCC）的侵襲性行為，揭示了腫瘤細(xì)胞通過外泌體拉攏正常細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移方式。在缺氧的條件下，HIF-1α迅速累積并反式激活基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）表達(dá)[20]，缺氧誘導(dǎo)外泌體裝載MMP-13改變微環(huán)境從而增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力和侵襲性。Rutgers Biomedical and Health Sciences （RBHS）的研究人員發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞會(huì)使間充質(zhì)干細(xì)胞釋放含有不同的miRNA（如miR-222/223）的外泌體，從而促進(jìn)一部分癌細(xì)胞處于靜止期，并獲得抗藥性[21]。

2.2 作為疾病的分子標(biāo)志物

外泌體內(nèi)攜帶有癌細(xì)胞的DNA、RNA和蛋白質(zhì)等信息，因此外泌體可以作為癌癥的診斷工具。在對(duì)胰腺癌患者的研究中，Melo等[22]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面蛋白多糖磷脂酰肌醇聚糖-1（glypican-1，GPC1）在胰腺癌患者血液外泌體中含量豐富，患者血清外泌體中GPC1能夠以100%的準(zhǔn)確率和敏感性診斷出早期胰腺癌。通過對(duì)急性中風(fēng)性患者及正常人進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)血清外泌體miR-9和miR-124的水平有希望作為生物標(biāo)志物用于急性缺血性中風(fēng)患者的診斷和缺血性損傷程度的評(píng)估[23]。DNM3、p65和p53在原始和復(fù)發(fā)性多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的腦和血液外泌體中都有類似的改變趨勢(shì)，可以作為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的潛在臨床診斷標(biāo)記[24]。多發(fā)性骨髓瘤患者血清外泌體中攜帶的miRNA中的兩個(gè)，即let-7b和miR-18a，在單變量分析中與無進(jìn)展生存期和總生存期顯著相關(guān)，因此let-7b和miR-18a可以作為多發(fā)性骨髓瘤疾病的分子標(biāo)志物[25]。以外泌體為基礎(chǔ)的診斷使得在癌癥病情發(fā)展過程中可及時(shí)監(jiān)測(cè)分子標(biāo)志物的變化，這種基于血液樣本的檢測(cè)比重復(fù)的組織活檢更容易收集樣本，更易監(jiān)控疾病的進(jìn)展。

2.3 作為藥物傳輸?shù)妮d體

外泌體表面表達(dá)各種粘連蛋白（跨膜蛋白和整合素）能夠促進(jìn)膜的相互作用和膜融合。用PEG-AA載體修飾裝載有紫杉醇的外泌體[26]，將改善藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間并能夠靶向肺轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞。Dong等[27]發(fā)現(xiàn)來自正常人的血清和肌管細(xì)胞的外泌體能夠攜帶（dysferlin，DYSF）蛋白到達(dá)DYSF敲除的小鼠細(xì)胞中，為蛋白缺陷或缺失造成的病癥提供了新的治療策略。利用間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢能力，同時(shí)工程化修飾細(xì)胞分泌富含miR-379的胞外囊泡，作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌的創(chuàng)新療法[28]。細(xì)胞外囊泡被嵌入到植入式生物材料中[29]，旨在利用酶前體藥物療法實(shí)現(xiàn)局部治療的藥物遞送?；赗NA的療法，將抗體樣（即Y形狀）RNA納米顆粒附著到微泡上可以有效地將RNA治療劑特異性地遞送給癌細(xì)胞[30]。外泌體作為具有生物活性的在細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)傳遞的系統(tǒng)，具有成為治療藥物載體的巨大潛力。

3 展望

在正常生理過程中外泌體發(fā)揮著介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的重要功能[31]，它們也能夠調(diào)節(jié)宿主-病原體的相互作用[32]，參與傳染性疾病、炎性疾病、神經(jīng)疾病和癌癥等多種疾病的病理過程，可作為干預(yù)及治療的潛在新靶點(diǎn)。隨著對(duì)外泌體研究的深入，外泌體在臨床醫(yī)學(xué)中有十分光明的應(yīng)用前景，主要是因?yàn)樗鼈償y帶有核酸和蛋白，有豐富的生物標(biāo)志物，可用于監(jiān)測(cè)臨床狀態(tài)、疾病進(jìn)展、治療反應(yīng)等。同時(shí)由于它們具有遞送生物分子的功能，可作為理想的藥物傳遞載體，通過將分子包裹在胞膜內(nèi)，可以保護(hù)酶或者RNA免于降解，并通過細(xì)胞內(nèi)吞作用來促進(jìn)細(xì)胞攝取。在再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面，與干細(xì)胞相比，外泌體體積更小，復(fù)雜性更低，易于生產(chǎn)和存儲(chǔ)，甚至更容易避免干細(xì)胞研究應(yīng)用面臨的一些監(jiān)管問題，同時(shí)干細(xì)胞外泌體不存在形成腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。此外，由于膜結(jié)合蛋白含量較低，外泌體的免疫原性低于干細(xì)胞。相信在不遠(yuǎn)的將來，基于外泌體本身的生理及病理功能可將外泌體應(yīng)用于疾病的診斷與治療，為患者帶來福音。目前，外泌體的功能還沒有完全闡明，外泌體內(nèi)攜帶的蛋白與核酸具有不確定性，外泌體與受體細(xì)胞的相互作用方式仍然不明確，這一系列問題都有待于科研人員的進(jìn)一步探索。

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（收稿日期：2018-04-28 本文編輯：封 華）