饒盼盼 黨松 王晞

[摘要] 目的 探討中成藥參松養(yǎng)心對(duì)日本大耳兔心肌梗死模型心肌微循環(huán)的作用及其可能的機(jī)制。 方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只6月齡SPF級(jí)日本大耳兔分為Sham組、Control組和MI+SSYX組，每組10只且雌雄各半。Control組和MI+SSYX組通過(guò)冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎建立心肌梗死模型，Sham組開胸后在冠狀動(dòng)脈下穿線，但不結(jié)扎。術(shù)后MI+SSYX組以參松養(yǎng)心0.4 g/（kg·d）溶液灌胃，Sham組和Control組以相同劑量的生理鹽水灌胃。灌胃4周后，將各組日本大耳兔全部處死，在梗死心肌周邊區(qū)取材，采用血管內(nèi)皮標(biāo)志物CD34免疫熒光染色法檢測(cè)微血管密度，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血漿中內(nèi)皮素-1（ET-1）、血栓素A2（TXA2）、一氧化氮（NO）和血管性血友病因子（vWF）的水平。 結(jié)果 與Sham組比較，Control組與MI+SSYX組微血管密度明顯降低（P < 0.05）；與Control組比較，MI+SSYX組微血管密度明顯升高（P < 0.05）。與Sham組比較，Control組及MI+SSYX組內(nèi)皮衍生因子ET-1、NO、TXA2、vWF血漿水平均顯著升高（P < 0.05）；與Control組比較，MI+SSYX組ET-1、TXA2、vWF血漿水平均降低，NO血漿水平升高（P < 0.05）。 結(jié)論 參松養(yǎng)心可改善心肌梗死后家兔心肌微循環(huán)，其機(jī)制可能與參松養(yǎng)心能夠促進(jìn)心肌梗死周邊區(qū)毛細(xì)血管生成，平衡內(nèi)皮衍生的血管擴(kuò)張因子和血管收縮因子的能力相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 參松養(yǎng)心；心肌梗死；微循環(huán)；內(nèi)皮衍生因子

[中圖分類號(hào)] R259.414 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）12（a）-0010-04

中藥參松養(yǎng)心是根據(jù)中醫(yī)絡(luò)病理論研制的復(fù)方制劑，主要由人參、麥冬、桑寄生、山萸肉、丹參、黃連、酸棗仁、五味子、赤芍、土鱉蟲、甘松等組成，有益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)、清心安神的功效[1]。該中藥是臨床上抗心律失常的常用藥，有研究表明參松養(yǎng)心有抗急性心肌缺血損傷的作用[2]，我們的前期研究也表明參松養(yǎng)心對(duì)心肌梗死亞急性期的微循環(huán)有改善作用[3]。本研究進(jìn)一步探究參松養(yǎng)心對(duì)心肌梗死家兔心肌微循環(huán)的影響并深入分析其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康6月齡SPF級(jí)日本大耳兔30只，體重2.2～2.7 kg（湖北省生物工程研究所，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：4200-499472），在武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室20～25℃恒溫飼養(yǎng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為Sham組、Control組和MI+SSYX組，每組由10只且雌雄各半。術(shù)后MI+SSYX組以參松養(yǎng)心原粉（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：S-131001）0.4 g/（kg·d）溶液灌胃，Sham組和Control組以相同劑量的生理鹽水灌胃。

1.2 動(dòng)物模型制備

采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎建立心肌梗死模型。動(dòng)物稱重后以0.8%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）耳緣靜脈麻醉，固定體位，頸部和胸部備皮。連接實(shí)驗(yàn)用心電監(jiān)護(hù)儀，觀察心電圖形態(tài)。酒精消毒，鋪無(wú)菌洞巾。調(diào)節(jié)呼吸機(jī)參數(shù)，行常規(guī)氣管插管。沿胸壁左旁正中開胸，用開胸器撐開切口，剪開心包，充分暴露心臟，尋找并結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支。以觀察到結(jié)扎以下心肌顏色變暗，搏動(dòng)幅度減弱，且心電監(jiān)護(hù)顯示Ⅰ、Ⅱ、aVL導(dǎo)聯(lián)ST段抬高0.2 mV為手術(shù)成功的標(biāo)準(zhǔn)。Sham組開胸后在冠狀動(dòng)脈左前降支下穿線，但不結(jié)扎。關(guān)閉并逐層縫合切口。術(shù)后各組家兔均接受40萬(wàn)U青霉素（華北制藥股份有限公司，批號(hào)：1204103）肌內(nèi)注射，連續(xù)3 d，預(yù)防感染。

1.3 免疫熒光檢測(cè)

治療4周后，將三組家兔全部處死，取梗死心肌周邊組織，用4℃生理鹽水清洗殘留血液后浸泡在4%多聚甲醛中固定24 h。經(jīng)梯度酒精脫水和石蠟包埋后，將石蠟切片浸入二甲苯脫蠟，梯度酒精中逐漸水化后行抗原修復(fù)，然后按照試劑盒（Abcam，批號(hào)：ab81289）說(shuō)明書進(jìn)行CD34及DAPI免疫熒光雙標(biāo)。每張切片在光學(xué)顯微鏡下放大400倍，隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行CD34染色陽(yáng)性計(jì)數(shù)（凡是染成棕黃色的血管內(nèi)皮細(xì)胞或者內(nèi)皮細(xì)胞簇均作為1個(gè)血管計(jì)數(shù)，管腔直徑超過(guò)2 μm或肌肉層超過(guò)3層的血管均不計(jì)數(shù)），并取5個(gè)區(qū)域的CD34陽(yáng)性計(jì)數(shù)的平均數(shù)作為該切片的微血管密度。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

治療4周后，三組家兔均通過(guò)采血針從頸靜脈抽取2 mL血注入真空分離膠促凝管中，靜置10 min后置于離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速3000 r/min、離心半徑8 cm離心15 min，收集上清液并放在-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。然后按照試劑盒（HCB，Canada）說(shuō)明書進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，檢測(cè)血漿樣本中內(nèi)皮素1（ET-1）、一氧化氮（NO）、血栓素A2（TXA2）和血管性血友病因子（vWF）水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌梗死模型

心肌梗死模型制備過(guò)程中，2只新西蘭大耳白兔意外死亡（1只死于心律失常，1只原因不明），剩余28只（Sham組10只、Control組9只、MI+SSYX組9只）均制備心梗模型成功，且順利完成各指標(biāo)的檢測(cè)。模型制備成功的心電圖見圖1。

2.2 三組家兔心肌梗死周邊區(qū)心肌微血管密度比較

與Sham組比較，Control組及MI+SSYX組微血管密度明顯降低（P < 0.05）。與Control組比較，MI+SSYX組微血管密度明顯升高（P < 0.05）。見圖2（封三）。

2.3 三組家兔ET-1、NO、TXA2和vWF血漿水平的比較

與Sham組比較，Control組及MI+SSYX組ET-1、NO、TXA2、vWF血漿水平均顯著升高（P < 0.05）。與Control組比較，MI+SSYX組ET-1、TXA2和vWF血漿水平均降低（P < 0.05），NO血漿水平升高（P < 0.05）。見圖3。

3 討論

本研究探究參松養(yǎng)心對(duì)心肌梗死的日本大耳兔心肌微循環(huán)的作用及其可能的機(jī)制。結(jié)果顯示，參松養(yǎng)心可以增加梗死心肌周邊區(qū)域的微血管密度，降低血漿中內(nèi)皮衍生子TXA2、ET-1、vWF水平，升高NO水平，即平衡內(nèi)皮衍生的血管擴(kuò)張因子和血管收縮因子，從而改善心肌梗死后梗死周邊組織心肌微循環(huán)。

中醫(yī)認(rèn)為急性心肌梗死為本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛包括氣、血、陰、陽(yáng)不足，以氣虛、陽(yáng)虛為主，標(biāo)實(shí)包括寒凝、氣滯、血瘀、痰濁，以血瘀、痰濁為主[4]。參松養(yǎng)心是基于中醫(yī)絡(luò)病學(xué)理論研制而成的具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)功效的中成藥。方中人參有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、生津安神等功效[5]。對(duì)于心血管系統(tǒng)，研究顯示人參能夠保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗心律失常、降壓、抑制心室重構(gòu)、改善高脂血癥、抗心源性休克等[6]。麥冬為常用的養(yǎng)陰中藥，藥理實(shí)驗(yàn)表明麥冬有很好的抗血栓作用，能增加心肌收縮力和冠脈流量，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[7]。丹參為臨床上常用的活血化瘀藥物，有抗氧化、抗血小板聚集、保護(hù)血管內(nèi)皮、改善微循環(huán)等藥理作用[8-9]。桑寄生有補(bǔ)肝腎、益精血、祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、養(yǎng)血脈、安胎元的作用。且有臨床研究表明，桑寄生對(duì)心律失常、心痛、短氣均有療效[10-11]。山茱萸能改善血管內(nèi)皮損傷，且與調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)ET/NO、TXA2/PGI2穩(wěn)態(tài)有關(guān)[12]。根據(jù)熱毒傷絡(luò)的假說(shuō)，黃連作為清熱解毒的代表藥，對(duì)梗死心肌血液循環(huán)也有改善作用[13-14]。酸棗仁能鎮(zhèn)靜催眠、保護(hù)心肌細(xì)胞、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血壓、降血脂、改善血液流變學(xué)以及加強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力等[15]。土鱉蟲是傳統(tǒng)的活血化瘀藥，中醫(yī)臨床上用于治療冠心病、高血壓，具有抗凝血、抗缺氧、調(diào)血脂、抗突變、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用[16]。甘松具有鎮(zhèn)靜降壓，抗心律失常、潰瘍、細(xì)胞毒活性、瘧疾的作用[17]。從藥方各組分藥理作用來(lái)看，參松養(yǎng)心為改善心肌梗死血液循環(huán)的對(duì)癥藥。

有研究表明，微血管功能障礙是決定急性心肌梗死（AMI）患者3個(gè)月后左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左室重塑程度的重要因素[18]。冠脈閉塞導(dǎo)致細(xì)胞壞死，引起毛細(xì)血管等微血管損傷及心肌再灌注損傷，最終引起水腫和微血管內(nèi)皮功能障礙，導(dǎo)致大約40%的AMI患者成功再灌注治療后出現(xiàn)心肌“無(wú)復(fù)流”現(xiàn)象（no-reflow phenomenon）[19-20]。因此，改善AMI患者的微血管功能是必要的治療措施。但目前AMI管理主要強(qiáng)調(diào)及時(shí)開放心臟表面的梗阻冠脈，治療主要集中在及時(shí)開通大血管上，重建走行于心肌內(nèi)的微血管血供并未得到臨床治療重視。血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)冠狀動(dòng)脈血流量主要通過(guò)釋放血管活性因子，其中NO是一種主要的內(nèi)皮細(xì)胞衍生的擴(kuò)血管因子[21-22]，ET-1是一種內(nèi)源性的血管活性肽，對(duì)冠狀動(dòng)脈發(fā)揮穩(wěn)定而持久的血管收縮作用，是最有效的血管收縮劑之一[23]。TXA2具有很強(qiáng)的促血小板聚集作用，是增加心肌梗死患者發(fā)病率和死亡率重要的風(fēng)險(xiǎn)因子之一[24-25]。生理狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞合成vWF，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞黏附于血管壁；病理狀態(tài)下，活化的血小板釋放vWF介導(dǎo)血管損傷部位的血小板聚集和黏附于膠原，促進(jìn)血栓形成[26-27]。參松養(yǎng)心能有效調(diào)節(jié)這兩類內(nèi)皮衍生因子，改善心臟微循環(huán)。

綜上所述，參松養(yǎng)心藥方的配伍原理及各成分的藥理作用與本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互支持，可以認(rèn)為參松養(yǎng)心能夠通過(guò)重建和維持AMI后心肌微血管灌注，起到保護(hù)心肌的作用。但有待進(jìn)一步研究以明確作用機(jī)制，如所涉及微循環(huán)保護(hù)的具體信號(hào)通路等。

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（收稿日期：2018-06-11 本文編輯：羅喬荔）