程 誠 曾永蕾 王 莖 吳 勇 冷玉玲孫 春 臧劉兵 尹亞男 劉 青

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 230001)(2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，合肥 230061) (3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，合肥 230038)

胃癌是全球高發(fā)的消化道惡性腫瘤之一，在亞洲范圍內(nèi)更為顯著，我國平均每年新增約40萬余例病人，是世界總發(fā)病例數(shù)的42%。從2005年開始，胃癌已經(jīng)成為中國癌癥發(fā)病率和死亡率第一的惡性腫瘤[1]?？梢?，胃癌已經(jīng)嚴(yán)重危害了我國人民群眾健康。因此，進一步研究胃癌的發(fā)病機制及探索新的治療方法，建立一種準(zhǔn)確高效的胃癌動物模型具有非常重要的意義。目前常用裸鼠建立胃癌動物腫瘤模型，但是裸鼠存在免疫缺陷，這對研究免疫功能產(chǎn)生了難度[2-4]。615小鼠屬于免疫功能正常的小鼠，且對胃癌細(xì)胞親緣性較好，為了更好地研究免疫功能，故采用615小鼠建?！，F(xiàn)擬采用胸膜穿刺針結(jié)合OB吻合膠粘貼法建模[5]，通過小鼠前胃癌細(xì)胞株(Mouse Forestomach Carcinoma Cell，MFC)來成功構(gòu)建615小鼠胃癌皮下移植瘤模型。本研究旨在為建立準(zhǔn)確高效的胃癌動物模型提供方法支持。

1 材料與方法

1.1 基本材料

胸膜穿刺針(上海埃斯埃醫(yī)械塑料制品有限公司，規(guī)格：2.0×65)；OB醫(yī)用吻合膠(廣州白云醫(yī)用膠有限公司，批號：160108)；10 cm眼科剪，10 cm眼科鑷，碘伏，棉簽均購自合肥摩爾生物科技有限公司；小鼠前胃癌細(xì)胞株(Mouse Forestomach Carcinoma Cell，MFC)購自武漢普諾賽生物科技有限公司。

1.2 實驗動物

無特定病原體(SPF)級615小鼠，6～8周齡，雌雄各半，體質(zhì)量(24±2)g，購自安徽中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，生產(chǎn)許可證：SCXY(皖)2014-0009。615小鼠養(yǎng)殖于安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室動物房。

1.3 試劑

多聚甲醛(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，含量不少于95%，規(guī)格：500 g/瓶，批號：20160617)。

1.4 儀器

脫水機(武漢俊杰電子有限公司型號：JJ-12 J)；包埋機(武漢俊杰電子有限公司 型號：JB-P5)；病理切片機(上海徠卡儀器有限公司 型號：JB-P5)；凍臺(武漢俊杰電子有限公司 型號：RM2016)；組織攤片機(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司 型號：JB-L5)；烤箱(天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司 型號：KD-P)；載玻片(Servicebio)；正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康 型號：Nikon Eclipse E100)；成像系統(tǒng)(日本尼康 型號：Nikon DS-U3)。

1.5 方法

1.5.1小鼠模型構(gòu)建：(1)MFC細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代 用含10%胎牛血清+90%培養(yǎng)基+1%雙抗培養(yǎng)MFC小鼠前胃癌細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，隔2 d換液，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿約90%時，按1∶3傳代于新培養(yǎng)皿中，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(2) 615小鼠胃癌皮下移植瘤的模型構(gòu)建 在無菌操作臺下收集MFC小鼠前胃癌細(xì)胞，制備成濃度為1×107個/mL的細(xì)胞懸液。碘伏消毒兩只615小鼠右腋下，1 mL注射器分別抽取0.2 mL細(xì)胞懸液注射進兩只小鼠右腋下。每天觀察，待瘤體長至直徑1 cm時，準(zhǔn)備下一步實驗。

(3)615小鼠胃癌皮下移植瘤的傳代 選擇一只成瘤小鼠處死[6]，將小鼠放于酒精里浸沒消毒，剝離腫瘤組織，清除包膜纖維、血管及壞死組織，然后放于PBS緩沖液中清洗干凈，正常的腫瘤組織，呈淡紅色魚肉狀。選取外觀形態(tài)較好的瘤體，剪成直徑約1 mm的小瘤塊備用。選取3只生長狀態(tài)良好的615小鼠，禁食12 h，以0.3%戊巴比妥鈉(0.2 mL/10 g)進行腹腔麻醉，固定小鼠于手術(shù)操作臺上，碘伏消毒小鼠右上肢腋窩處，拿出胸膜穿刺針(為套管針，結(jié)構(gòu)分為兩個部分，一部分是外針管，一部分是內(nèi)推桿)，操作時把推桿往后抽，空出針的前段部分，將備好的小瘤塊用眼科鑷子夾起從針頭方向塞入針內(nèi)，刺入右腋皮下，進針深度控制在0.5～0.7 cm，推動推桿到底，隨后用OB吻合膠粘合腋下針孔。每天觀察，當(dāng)瘤體長至直徑為1 cm時脫頸處死小鼠，按以上方法在體內(nèi)傳代三次。第三次取出腫瘤，作為模型組移植瘤源。

(4)615小鼠胃癌皮下移植瘤模型的建立 將移植瘤源剪成直徑約1 mm的瘤塊備用[7]。選取生長狀態(tài)良好的615小鼠20只隨機分成兩組，禁食12 h。模型組按上述方法建模，對照組除不放入瘤塊，其余步驟方法與模型組一致。隔天測一次小鼠體質(zhì)量，每24 h觀察小鼠右腋下皮膚，以判斷體質(zhì)量變化及成瘤情況。每三天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小，按公式V=π/6×長×寬×高，計算腫瘤大小，并繪制生長曲線。

1.5.2處理動物:觀察21 d后處死615小鼠，剝離出腫瘤組織，瘤塊稱重。標(biāo)本浸于4%多聚甲醛中保存，然后石蠟固定，最后進行HE染色。HE染色后，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析[8]。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量變化情況

從造模起始，隔3天取小鼠平均體質(zhì)量值，繪制小鼠體質(zhì)量隨時間變化曲線(圖1)。起始時，對照組和模型組體質(zhì)量無明顯變化，7 d后，兩組小鼠體質(zhì)量發(fā)生不同變化，其中對照組體質(zhì)量增長12.84%，模型組體質(zhì)量下降3.59%(表1)。因腫瘤細(xì)胞會消耗機體的大部分能量，進而導(dǎo)致體質(zhì)量下降，間接地證明了模型組造模成功。

圖1 兩組小鼠體質(zhì)量變化情況Fig.1 body weight changes in the two groups of mice

組別group動物數(shù)量/只Animal quantity體質(zhì)量/gbody Weight/g測量開始Measurement start測量結(jié)束End of measurement體質(zhì)量增加/%Weight gain/%對照組False model group1024.62±2.0227.78±1.5112.84模型組Model group1024.51±1.5223.63±1.93-3.59

2.2 腫瘤生長狀況

3～5 d潛伏期后，接種部位皮下可見灰白色結(jié)節(jié)，后呈圓形或橢圓形生長，每3天測量一次腫瘤體積大小(表2)。繪制腫瘤生長曲線(圖2)。腫瘤在第12天后生長較快,前期生長較慢，成功率為100%。

表2 腫瘤體積

圖2 腫瘤生長曲線Fig.2 the growth curve of the tumor

2.3 外觀形態(tài)和解剖觀察

皮下移植瘤10 d可長至直徑1 cm大小，生長迅速，可作為小鼠瘤源，進行皮下移植。模型組10只小鼠在皮下移植21 d后，均可在右腋下觸及腫塊(圖3)。經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)，10只615小鼠全部成瘤，成瘤率為100%。腫瘤組織呈肉紅色，表面不均勻呈結(jié)節(jié)狀，觸之較硬。進一步觀察，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織多與皮膚粘連，并向胸膜浸潤。對照組沒有腫瘤生成。

圖3 腋下腫塊Fig.3 subaxillary mass

2.4 瘤重結(jié)果

如表3所示：10只模型組內(nèi)的615小鼠接種21d后，平均瘤質(zhì)量為(7.7160±0.2937)g，提示腫瘤生長大致相同，瘤質(zhì)量差異較小(圖4、5、6)。對照組無腫瘤生成，平均瘤質(zhì)量為0 g，兩組之間差異顯著(P<0.01)。

表3 615小鼠平均瘤重Table 3 Average tumor weight in the 615 mice

注：與對照組組比較*P<0.01

Note：compared with the control group,*P<0.01

圖4 腋下移植瘤Fig. 4 axillary transplantation tumor

圖5 腋下移植瘤Fig.5 axillary transplantation tumor

圖6 腋下移植瘤Fig.6 axillary transplantation tumor

2.5 病理結(jié)果

HE病理染色結(jié)果判讀(細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色)。結(jié)果可見瘤塊體積較大，表面不規(guī)則，外觀粉紅，切面灰白，呈魚肉狀，血供豐富，包膜較完整。細(xì)胞核呈圓形、卵形或異型，深染，大小不等，形狀不一，排列不規(guī)則，核仁不顯現(xiàn)， 核分裂相較明顯，是比較典型的胃癌組織的形態(tài)特征。如圖7。

圖7 腫瘤組織HE染色結(jié)果(×400)Fig.7 HE staining (×400)

3 討論

常見的人胃癌裸鼠移植瘤造模有細(xì)胞接種法和勻漿法，這兩種造模方法對細(xì)胞濃度及細(xì)胞質(zhì)量要求較高，在操作過程中，易造成細(xì)胞死亡，成瘤率低，瘤塊差異大[9]。然而采用胸膜穿刺針聯(lián)合OB吻合膠構(gòu)建615小鼠胃癌移植瘤模型，該方法操作相對簡單，傷口小，速率快，成瘤率高，恢復(fù)快，瘤塊差異小。本研究所建立的造模方法為今后研究相關(guān)實驗動物移植瘤模型的構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)提供了較為可靠的數(shù)據(jù)。

實驗選擇近交系615小鼠作為實驗動物移植瘤模型的構(gòu)建，不但因為其生命力頑強，飼養(yǎng)簡單，而且它的遺傳穩(wěn)定性保證了接種成功率，它比裸鼠簡單經(jīng)濟，比普通小鼠穩(wěn)定[10]。裸鼠是免疫缺陷動物，必須生存在SPF環(huán)境中，其價格昂貴[11]。體質(zhì)量小，發(fā)育緩慢，生長周期長，建模周期長(4～5周)。與615小鼠的2～3周相比，裸鼠建模太過漫長。MFC細(xì)胞系是來源于小鼠前胃癌的上皮腫瘤細(xì)胞系，而且仍然保持著原來615小鼠前胃癌自發(fā)血道轉(zhuǎn)移的特性[12]，因此小鼠前胃癌細(xì)胞株(MFC)與615小鼠有較好的親緣性，是其良好的宿體。因此，MFC細(xì)胞系被選為615小鼠移植瘤的模型。

實驗過程中的注意事項：為確保穿刺針在皮下順利刺入，皮膚應(yīng)盡量平展，避免緊繃，接種時進針點下移約1 mm，針頭在皮下移動一段再緩慢注射。注射前活動針頭，如能活動表明針頭在皮下，即可避免穿入胸腔造成小鼠死亡，否則會導(dǎo)致瘤塊與胸膜粘連而使瘤塊剝離困難。鑒于OB吻合膠在潮濕情況下易催化成固體，因此在植入瘤塊前需要盡量減少瘤塊濕度及滲液，來減少OB吻合膠與組織粘連。同時需要注意，615小鼠生性比較兇猛，易互相打斗相殘，造模后應(yīng)加強護理(雌雄小鼠分籠飼養(yǎng)，性情兇猛的單籠飼養(yǎng)，備足飼料及飲水，飼養(yǎng)環(huán)境要保證光線充足)，如此可有效避免打斗相殘及不必要的死亡。

實驗中的問題：瘤塊接種時會出現(xiàn)腫瘤生長不均勻的情況，除因為針管不夠光滑導(dǎo)致瘤塊掛針外，還因為瘤塊準(zhǔn)備過程中的不當(dāng)操作，很難保證每個小鼠的腫瘤大小相同，這些接種過程中的微小差異可以在成瘤后產(chǎn)生巨大差別。為了盡量減小此類差異，需仔細(xì)挑選光滑針管，并用細(xì)小瘤塊反復(fù)測試針管。為了避免瘤塊大小不一，先用精準(zhǔn)標(biāo)尺把腫瘤組織切成厚度為1 mm的組織切塊若干份，選取切面面積較大的切塊，然后用精準(zhǔn)標(biāo)尺在切塊上每1 mm寬度標(biāo)記一個位置，再用手術(shù)刀精準(zhǔn)切開組織成條形，選取切面均勻的條形，再按1 mm寬度切成塊狀，選出切面均勻的瘤塊作為實驗瘤塊，放入培養(yǎng)基里以保證腫瘤細(xì)胞活性，如此可大幅度地減少差異。眾所周知，腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程，腫瘤細(xì)胞或者腫瘤組織在小鼠體內(nèi)被接種后，能否發(fā)生轉(zhuǎn)移，除與接種途徑和接種位置有關(guān)外,還與腫瘤組織的分化程度、小鼠的生理狀態(tài)有關(guān)。另外，小鼠如果受細(xì)菌、病毒等感染時,還會增強抗原刺激，進而使NK細(xì)胞等非T細(xì)胞依賴性免疫活性受到影響，最后導(dǎo)致移植腫瘤的成活率及轉(zhuǎn)移發(fā)生率也受到影響。處理好這些問題，不但需要增加樣本統(tǒng)計、嚴(yán)格執(zhí)行隨機分組的實驗原則，還更加需要科研人員具備嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度，并且盡可能減少人為誤差，這樣建立實驗?zāi)Ｐ筒拍芨项A(yù)期目標(biāo)[13]。