王 洪 魏 杰 邢 進(jìn) 鞏 薇 岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629)

無(wú)論是藥物的研發(fā)還是藥品的質(zhì)量控制都離不開動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)必須要使用標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物才能獲得重復(fù)性好，具參考性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須通過(guò)全方位的質(zhì)量控制來(lái)實(shí)現(xiàn)。遺傳質(zhì)量控制是其中尤為重要的一環(huán)。遺傳質(zhì)量控制的主要方法之一是生化標(biāo)記檢測(cè)法。該方法是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量控制的經(jīng)典方法。選擇一些在品系間具有多態(tài)性的同工酶和異構(gòu)蛋白作為生化標(biāo)記，生化標(biāo)記的差異體現(xiàn)的是編碼該生化標(biāo)記的DNA序列的差異。不同品系具有各自獨(dú)特的生化標(biāo)記基因。生化標(biāo)記檢測(cè)法涵蓋14個(gè)生化標(biāo)記位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)都需要相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量評(píng)價(jià)的結(jié)果判定。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研發(fā)與應(yīng)用，一方面可以節(jié)約檢驗(yàn)時(shí)間，提高工作效率；另一方面可以有效減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用量，符合動(dòng)物倫理和3R原則[1-2]。

生化標(biāo)記檢測(cè)法的14種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量評(píng)價(jià)，同時(shí)也在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物領(lǐng)域的能力驗(yàn)證活動(dòng)中廣泛應(yīng)用。本研究主要對(duì)5個(gè)生化標(biāo)記(蘋果酸酶-1、異檸檬酸脫氫酶-1、堿性磷酸酶-1、過(guò)氧化氫酶-2和肽酶-3)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性展開研究。評(píng)價(jià)溫度和時(shí)間對(duì)5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的影響。以期獲得該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保存條件和運(yùn)輸條件，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量評(píng)價(jià)使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

10只SPF級(jí)8周齡雄性C57BL/6小鼠和10只SPF級(jí)8周齡雌性BABL/c小鼠，均來(lái)源于國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心[SCXK(京) 2014—0013]。10只SPF級(jí)8周齡雌性CBA小鼠，來(lái)源于上海斯萊克有限公司[SCXK(滬) 2012—0002]。按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 樣品制備

采用安樂(lè)死處死動(dòng)物，剖腹，取小鼠腎臟2只，加入預(yù)冷的蒸餾水，蒸餾水與腎臟的比例為2∶1(V/W)。用組織勻漿器勻漿，然后置4 ℃低溫高速離心機(jī)中，15 000 r/min，30 min。取上清，加保護(hù)劑，分裝，裝量70 mg/瓶，用凍干機(jī)，凍干。小鼠腎勻漿凍干樣品為紅色固體。加蓋，封口膜封口，封口袋包裝。采用隨機(jī)數(shù)字方式編號(hào)。貯藏條件為密封，冷藏[3-5]。

1.3 穩(wěn)定性檢驗(yàn)[6]

1.3.1分別將時(shí)間和溫度設(shè)為橫、縱坐標(biāo)，設(shè)定-20 ℃，4℃，室溫和37 ℃ 4個(gè)溫度檢驗(yàn)點(diǎn)，設(shè)定1、2、3、7、14、30、60、90 d為8個(gè)時(shí)間檢驗(yàn)點(diǎn)，在每個(gè)坐標(biāo)交點(diǎn)，隨機(jī)抽取1瓶進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.3.2在取出日期，依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T14927.1—2008對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，觀測(cè)穩(wěn)定性結(jié)果[6]。所有樣品均需加入70 μL蒸餾水還原。

1.3.3記錄不穩(wěn)定結(jié)果出現(xiàn)的時(shí)間和溫度，本測(cè)定的觀測(cè)周期為90 d時(shí)長(zhǎng)。

1.3.4匯總穩(wěn)定性結(jié)果，填寫各自時(shí)間、溫度穩(wěn)定性結(jié)果報(bào)告單。

1.3.5穩(wěn)定性結(jié)果判定：如發(fā)現(xiàn)任何1瓶發(fā)生條帶模糊不可讀，則認(rèn)為在該觀測(cè)點(diǎn)樣品的穩(wěn)定性已經(jīng)發(fā)生了變化，即在該時(shí)間溫度條件下該樣品不穩(wěn)定。

2 結(jié)果

共制備堿性磷酸酶-1標(biāo)準(zhǔn)品60份。肽酶-3、過(guò)氧化氫酶-2、蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1標(biāo)準(zhǔn)品共178份。

蘋果酸酶-1樣本在37 ℃條件下穩(wěn)定至第1天，在保存至第2天時(shí)，條帶模糊，無(wú)法辨認(rèn)。在室溫條件下，該樣本可穩(wěn)定保存至3 d。在4 ℃和-20 ℃可以穩(wěn)定保存至90 d。異檸檬酸脫氫酶-1樣本在37 ℃條件下穩(wěn)定至第1天，在保存至第2天時(shí)，條帶模糊，無(wú)法辨認(rèn)。在室溫條件下，該樣本可穩(wěn)定保存至3 d。在4 ℃和-20 ℃可以穩(wěn)定保存至90 d。堿性磷酸酶-1樣本在37 ℃條件下穩(wěn)定至第1天，在保存至第2天時(shí)，條帶模糊，無(wú)法辨認(rèn)。在室溫條件下，該樣本可穩(wěn)定保存至5 d。在4 ℃和-20 ℃可以穩(wěn)定保存至90 d。過(guò)氧化氫酶-2樣本在37 ℃條件下穩(wěn)定至第3天。在室溫條件下，該樣本可穩(wěn)定保存至3 d。在4 ℃和-20 ℃可以穩(wěn)定保存至90 d。肽酶-3樣本在37 ℃條件下穩(wěn)定至第1天，在保存至第2天時(shí)，條帶模糊，無(wú)法辨認(rèn)。在室溫條件下，該樣本可穩(wěn)定保存至14 d。在4 ℃和-20 ℃可以穩(wěn)定保存至90 d。詳見(jiàn)表1。

如圖1所示，在室溫條件下，蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)放置1、2、3、7 d和14 d的電泳條帶，1、2和3 d的條帶清晰可見(jiàn)。7 d和14 d的電泳條帶模糊，無(wú)法辨認(rèn)。如圖2所示，在4 ℃和-20 ℃條件下，堿性磷酸酶-1的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)放置30 d、60 d和90 d的電泳條帶，清晰可見(jiàn)。如圖3所示，在4 ℃和-20 ℃條件下，過(guò)氧化氫酶-2的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)放置30 d、60 d和90 d的電泳條帶，清晰可見(jiàn)。如圖4所示，在4 ℃和-20 ℃條件下，肽酶-3的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)放置30 d、60 d和90 d的電泳條帶，清晰可見(jiàn)。

表1 五種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果Table 1 Stability results of 5 standard substances

圖1 蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1 在室溫條件下的電泳結(jié)果注： 1∶1d； 2∶2d； 3∶3d； 4：Marker1(b,a)；5：Marker2(b,b)； 6：Marker3(a,a)；7:7d； 8：14d Fig.1 Electrophoresis results of Mod1 andIdh1 in room temperatureNote: 1:1d； 2:2d； 3:3d； 4：Marker1(b,a)；5：Marker2(b,b)；6：Marker3(a,a)；7:7d； 8:14d

圖2 堿性磷酸酶-1在4 ℃(1-3)和-20 ℃(7-9)存放后的電泳結(jié)果注：1：30d； 2：60d； 3：90d；4：Marker1(a)；5：Marker2(b)； 6：Marker3(b)； 7：30d； 8：60d； 9：90dFig.2 Electrophoresis results of Akp1 in4 ℃(1-3)and -20 ℃(7-9)Note: 1：30d； 2：60d； 3：90d； 4：Marker1(a)；5：Marker2(b)； 6：Marker3(b)；7：30d； 8：60d；9：90d

圖4 肽酶-3在4 ℃(1-3)和-20 ℃(7-9)存放后的電泳結(jié)果注：1：30d； 2：60d； 3：90d；4：Marker1(a)；5：Marker2(a)； 6：Marker3(b)； 7：30d； 8：60d； 9：90dFig.4 Electrophoresis results of Pep3 in 4 ℃(1-3)and -20 ℃(7-9)Note: 1：30d； 2：60d； 3：90d；4：Marker1(a)；5：Marker2(a)； 6：Marker3(b)；7：30d； 8：60d；9：90d

3 討論

3.1 貯存條件和運(yùn)輸條件

溫度升高將導(dǎo)致蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性喪失，酶的生物學(xué)功能失效。生化標(biāo)記方法是通過(guò)生物化學(xué)方法染色來(lái)識(shí)別不同品系動(dòng)物在各生化標(biāo)記位點(diǎn)的差異。一旦酶的生物學(xué)功能喪失，將無(wú)法通過(guò)酶類的不同基因型將不同品系的動(dòng)物區(qū)分開來(lái)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)一旦喪失穩(wěn)定性，將無(wú)法作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。因此，溫度是決定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性的重要因素之一。本研究選擇了4個(gè)溫度點(diǎn)和8個(gè)時(shí)間點(diǎn)。選擇室溫，而不是設(shè)定為25 ℃，是希望溫度條件盡量接近真實(shí)情況。本研究工作的實(shí)施時(shí)間是在北京5—7月。室溫在30 ℃左右。以肽酶-3為例，本研究中肽酶-3在室溫條件下可以穩(wěn)定保存14 d。而有研究發(fā)現(xiàn)，在北京1—2月，室溫在20 ℃左右的情況下，肽酶-3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以在室溫穩(wěn)定存放28 d。因此，室溫狀態(tài)下的實(shí)際溫度，因地域而異，因季節(jié)而異。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不應(yīng)在室溫狀態(tài)下長(zhǎng)期存放。在4 ℃和-20 ℃條件下，5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均可以穩(wěn)定保存至90 d。可見(jiàn)，4 ℃和-20 ℃是適于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長(zhǎng)期保存的溫度。而37 ℃對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來(lái)說(shuō)，是極不穩(wěn)定的溫度。除了過(guò)氧化氫酶-2可以穩(wěn)定3 d以外，其它4種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)只能穩(wěn)定1 d。因此，在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備完成到使用之前的貯存條件應(yīng)嚴(yán)格控制在4 ℃以下。如果涉及到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的運(yùn)輸，應(yīng)全程控制溫度。因此，無(wú)論是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的貯存，還是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的運(yùn)輸都必須嚴(yán)格控制溫度。

3.2 不同位點(diǎn)的穩(wěn)定性存在差異

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的14個(gè)生化標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對(duì)溫度的敏感程度各不相同，不同位點(diǎn)的穩(wěn)定性存在差異。過(guò)氧化氫酶-2比其他位點(diǎn)在37 ℃穩(wěn)定的時(shí)間更久(3 d)。不同位點(diǎn)需要分別做穩(wěn)定性檢驗(yàn)。保證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性，同時(shí)也是遺傳質(zhì)量評(píng)價(jià)工作順利開展的保障[7]。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在能力驗(yàn)證活動(dòng)中的應(yīng)用

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性對(duì)于能力驗(yàn)證活動(dòng)的開展也至關(guān)重要。能力驗(yàn)證可通過(guò)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，確定實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)或校準(zhǔn)能力，能力驗(yàn)證樣品的一致性對(duì)能力驗(yàn)證的整個(gè)過(guò)程至關(guān)重要。在實(shí)施能力驗(yàn)證計(jì)劃時(shí)，組織方應(yīng)確保能力驗(yàn)證中出現(xiàn)的不滿意結(jié)果不歸咎于樣品之間或樣品本身的變異性。因此，對(duì)于能力驗(yàn)證樣品的檢測(cè)特性量，須進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)和(或)穩(wěn)定性檢驗(yàn)。國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量檢測(cè)中心負(fù)責(zé)全國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)機(jī)構(gòu)遺傳生化標(biāo)記位點(diǎn)堿性磷酸酶-1等14個(gè)項(xiàng)目的能力驗(yàn)證評(píng)價(jià)計(jì)劃的實(shí)施。我們通過(guò)評(píng)價(jià)堿性磷酸酶-1、過(guò)氧化氫酶-2、肽酶-3、蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1這5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性，以確保發(fā)出的能力驗(yàn)證樣品完全符合要求。在能力驗(yàn)證提供者認(rèn)可評(píng)審以及監(jiān)督評(píng)審中，樣本的穩(wěn)定性檢驗(yàn)都是重要的考察項(xiàng)[3]。

通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在室溫波動(dòng)較大和37 ℃極不穩(wěn)定，在4 ℃和-20 ℃，可以長(zhǎng)期穩(wěn)定。說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是一類對(duì)溫度較為敏感的物質(zhì)。有必要嚴(yán)格控制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保存條件和運(yùn)輸條件。依據(jù)本研究獲得的穩(wěn)定性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)可以為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的應(yīng)用提供技術(shù)保障。