鐘志勇 馮學軒 嚴家榮 劉盛來 劉驥德 鄭玉連 唐小江

(廣東省醫(yī)學實驗動物中心，廣州 528248)

慢性尿路感染(Chronic urinary tract infection, CUTI)是臨床常見的泌尿系統(tǒng)感染性疾病，主要指細菌、真菌等微生物病原體在尿路中異常生長、繁殖、侵犯黏膜或組織，繼而引起以尿路刺激癥狀為主要臨床特征的泌尿系統(tǒng)常見病[1-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學對于CUTI的研究表明，腸道革蘭氏陰性菌中的大腸埃希菌為CUTI的常見致病菌，約占70%～90%[4-6]?；颊吒腥竞罂沙霈F(xiàn)腰膝酸軟、尿頻、尿急、尿痛、排尿淋漓不盡、下腹墜脹等癥狀[7]，此病發(fā)病率高，受累群眾廣[8]，嚴重影響患者的心理和生理健康。因此，研發(fā)有效的治療藥物顯得尤為迫切，但要進行藥物的研究和篩選，必須建立合適的實驗動物模型，這樣才能更好地“對癥下藥”。目前，針對CUTI的研究大多局限于造模—給藥—指標檢測這樣的研究模式當中，對于CUTI動物模型的動態(tài)變化并沒過多的研究，因此對于模型發(fā)病高峰，病程，病情的發(fā)展也并沒太多的了解，此舉極有可能造成在實驗過程中用藥時機不當，進而影響藥效的評價，得出假陰假陽的結(jié)果。

據(jù)此，本文擬通過膀胱內(nèi)注入定量大腸埃希菌，建立慢性尿路感染大鼠模型，并在疾病發(fā)展過程中定期進行體溫、尿菌、尿白細胞、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、血常規(guī)等動態(tài)監(jiān)測，并設(shè)左氧氟沙星陽性對照組，首次探討此類造模方法建立的CUTI模型的動態(tài)變化情況以及抗菌藥物干預后的疾病發(fā)展情況，為日后CUTI模型的完善及應(yīng)用于藥物開發(fā)提供基礎(chǔ)的實驗資料及參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境：SPF級SD大鼠，30只，雌性，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，合格證號：44007200014887；動物飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學實驗動物中心SPF級動物房的IVC系統(tǒng)中，實驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2013-0002。單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度與濕度：20～26 ℃，40%～70%，采用10 h∶14 h晝夜間斷照明。動物自由進食和飲水，所有飼料和飲用水均由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。

1.1.2藥物及主要試劑：鹽酸左氧氟沙星片：批號A1401001、A1401002，哈藥集團制藥總廠，按100 mg∶20 mL的質(zhì)量體積比配制成5 mg/mL的藥液；尿素氮(BUN)試劑盒：批號20140332，上?？迫A生物工程股份有限公司生產(chǎn)；肌酐(Cr)試劑盒：批號20140112，上?？迫A生物工程股份有限公司生產(chǎn)；大腸桿菌O111B4菌株：由廣東省中醫(yī)院微生物檢測室贈送。

1.1.3主要儀器:BS-3000A電子分析天平：精度0.1 g，上海友聲衡器有限公司；DHG-9245A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；LMQ.C立式滅菌器：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；RM2135輪轉(zhuǎn)切片機：德國LEICA公司；TS-12C生物組織全自動脫水機：湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司；BM-VII生物組織包埋機及冷凍機：湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司；CS-VI攤片烤片機：湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司；RS-18生物組織全自動染色機：湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司；BX43病理圖像分析系統(tǒng)：日本奧林巴斯。

1.2 方法

雌性SPF級SD大鼠，30只。檢疫合格后，隨機分為假手術(shù)組、模型對照組、鹽酸左氧氟沙星組，10只/組。實驗前大鼠禁食禁水12 h，術(shù)前大鼠經(jīng)手按壓膀胱使排空膀胱內(nèi)殘留尿液后，按0.2 mL/100 g體質(zhì)量經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉進行麻醉，仰位固定大鼠，下腹部剃毛后，醫(yī)用酒精消毒，無菌操作下，在下腹膀胱位置，切開腹壁1～3 cm，暴露膀胱，手持鑷子固定膀胱，用1 mL滅菌注射器吸取大腸桿菌液(密度為107個/mL)，按0.5 mL/只的體積緩慢注入膀胱內(nèi)，腹壁縫合、消毒，夾住尿道口兩側(cè)皮膚后放回籠內(nèi)，繼續(xù)禁水飼養(yǎng)6 h。假手術(shù)組不注入大腸桿菌，其余操作一致。鹽酸左氧氟沙星組按2 mL/100 g體質(zhì)量的劑量灌胃5 mg/mL鹽酸左氧氟沙星片藥液，假手術(shù)組和模型對照組給予等量純凈水，連續(xù)30 d。造模當天測量大鼠體溫，采集血液測定血常規(guī)、收集尿液測尿白細胞及尿細菌數(shù)。

1.3 檢測指標

1.3.1觀察：每天觀察動物的一般臨床情況，若有死亡動物應(yīng)及時進行解剖，并觀察內(nèi)臟各器官形態(tài)變化。

1.3.2體質(zhì)量：實驗期間每周測量體質(zhì)量1次。

1.3.3體溫： 實驗期間每周測量體溫1次。

1.3.4血常規(guī)、BUN、Cr的測定： 實驗期間每周經(jīng)眼眶采EDTA抗凝血測量血常規(guī)1次，采促凝血，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，取血清測定BUN及Cr含量。

1.3.5尿白細胞及尿細菌：實驗期間每周采用代謝籠收集4 h尿液測定大鼠尿白細胞、尿細菌1次，代謝籠使用完畢立刻消毒。

1.3.6腎臟和膀胱臟器感染菌計數(shù)：實驗結(jié)束當天(第30天)，在無菌條件下，各組大鼠均取右側(cè)腎臟及一半的膀胱組織，分別稱重后剪碎，右腎加5 mL無菌生理鹽水勻漿；一半膀胱加1 mL滅菌生理鹽水勻漿。吸取50 μL勻漿液于瓊脂平皿培養(yǎng)基上均勻鋪開，置37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，進行菌落形成數(shù)(colony formation unit, CFU) 計數(shù)。每只動物的菌落數(shù)以每毫克濕組織所能培養(yǎng)出的CFU 計算。

1.3.7病理學檢測：各組大鼠取左側(cè)腎組織及另一半膀胱組織，4%中性甲醛固定后，常規(guī)石蠟切片，HE染色，進行病理組織學檢查，并按表1進行評分[10]。

表1 組織病理學評分表Table 1 Histopathological evaluation scale

1.4 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量測量結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型對照組造模后第14、21天體質(zhì)量明顯降低，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；與模型對照組相比，鹽酸左氧氟沙星組體質(zhì)量無統(tǒng)計學差異(P>0.05),見圖1。

2.2 體溫測量結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型對照組造模后第14、21天體溫升高明顯，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；與模型對照組相比，鹽酸左氧氟沙星組體溫有所降低，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05),見圖2。

圖1 實驗期間各組大鼠體質(zhì)量變化情況注:與假手術(shù)組相比，△P<0.05，△△P<0.01Fig.1 The body weight of each group during the experiment periodNote: Compared with the Sham group, △P<0.05，△△P<0.01

圖2 實驗期間各組大鼠體溫變化情況注:與假手術(shù)組相比， △△P<0.01Fig.2 The body temperature of each group during the experiment periodNote: Compared with the Sham group, △△P<0.01

2.3 尿細菌數(shù)測定結(jié)果

造模前各組間尿細菌數(shù)無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。造模后，與假手術(shù)組相比，模型對照組第7～28天各測定時間點尿細菌數(shù)明顯增加，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；與模型對照組相比，鹽酸左氧氟沙星組第7～28天各測定時間點，尿細菌數(shù)明顯減少，有統(tǒng)計學差異(P<0.05),見表2。

2.4 腎臟、膀胱感染菌結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組膀胱染菌數(shù)和腎臟染菌數(shù)明顯增加，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；與模型對照組相比，鹽酸左氧氟沙星膀胱染菌數(shù)和腎臟染菌數(shù)均明顯減少，有統(tǒng)計學差異(P<0.05),見表3。

表2 各組大鼠尿細菌數(shù)變化情況♀)Table 2 Number of urine bacterial in each ♀)

注：采用重復測量方差分析方法進行統(tǒng)計分析。與假手術(shù)組相比，△△P<0.01；與模型對照組相比，**P<0.01

Note：Repeated measures anova was used for statistical analysis.Compared with the Sham group,△△P<0.01; Compared with the Model group,**P<0.01

表3 各組大鼠腎臟、膀胱感染菌結(jié)果♀)Table 3 Number of kidney and bladder bacterial in♀)

注：腎臟染菌數(shù)采用sin轉(zhuǎn)換后方差分析，膀胱染菌數(shù)采用秩和檢驗的統(tǒng)計方法進行分析。與假手術(shù)組相比，△△P<0.01；與模型對照組相比，**P<0.01

Note：Anova was used after sin transformation for kidney bacterial statistical analysis. Rank sum test was used for bladder bacterial statistical analysis。Compared with the Sham group,△△P<0.01; Compared with the Model group,**P<0.01

2.5 血清BUN值、血清Cr值：

各組動物在各測定時間點的血清BUN值、Cr值均未見有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.6 血常規(guī)

2.6.1白細胞數(shù)及分類：與假手術(shù)組相比，模型對照組第7、14、21天白細胞數(shù)升高有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，在白細胞分類中，淋巴細胞數(shù)、嗜堿性粒細胞數(shù)、單核細胞數(shù)、中性粒細胞數(shù)、嗜酸性粒細胞數(shù)在各測定時間點上均未見統(tǒng)計學差異(P>0.05)；與模型對照組相比，鹽酸左氧氟沙星組第0、7、14天嗜酸性粒細胞數(shù)升高有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，其余白細胞指標無統(tǒng)計學差異(P>0.05),表4～6。

表4 各組大鼠白細胞、淋巴細胞數(shù)♀)Table 4 The number of white blood cells and lymphocytes in each ♀)

注：采用重復測量方差分析方法進行統(tǒng)計分析。與假手術(shù)組相比，△P<0.05

Note：Repeated measures anova was used for statistical analysis. Compared with the Sham group,△P<0.05

表5 各組大鼠單核細胞、中性粒細胞數(shù)♀)Table 5 The number of monocytes and neutrophils in each ♀)

注：采用重復測量分析方法進行統(tǒng)計分析

Note：Repeated measures anova was used for statistical analysis

2.6.2紅細胞及血紅蛋白濃度：與假手術(shù)組相比，模型對照組第0、7、14、28天紅細胞數(shù)升高，第7、14天血紅蛋白濃度升高有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；與模型對照組相比，鹽酸左氧氟沙星組紅細胞及血紅蛋白濃度在各測定時間點無統(tǒng)計學差異(P>0.05),表7。

2.6.3血小板數(shù)：各組動物在各測定時間點的血小板數(shù)均未見有統(tǒng)計學意義(P>0.05),表8。

表6 各組大鼠嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞數(shù)♀)Table 6 The number of eosinophil and basophil in each ♀)

注：采用重復測量方差分析方法進行統(tǒng)計分析。與模型對照組相比，*P<0.05,**P<0.01

Note：Repeated measures anova was used for statistical analysis. Compared with the Model group,*P<0.05,**P<0.01

表7 各組大鼠紅細胞數(shù)、血紅蛋白濃度♀)Table 7 Results of erythrocyte count and hemoglobin concentration in each ♀)

注：采用重復測量方差分析方法進行統(tǒng)計分析。與假手術(shù)組相比，△P<0.05,△△P<0.01

Note：Repeated measures anova was used for statistical analysis. Compared with the Sham group,△P<0.05,△△P<0.01

表8 各組大鼠血小板數(shù)♀)Table 8 The number of platelet in each ♀)

注：采用重復測量分析方法進行統(tǒng)計分析

Note：Repeated measures anova was used for statistical analysis

2.7 組織病理學檢測

2.7.1評分結(jié)果：與假手術(shù)組相比，模型對照組病理學評分升高有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。與模型對照組相比，鹽酸左氧氟沙星組病理學評分下降有統(tǒng)計學差異(P<0.05),見表9。

2.7.2組織病理學觀察：假手術(shù)組膀胱及腎臟結(jié)構(gòu)均無異常。模型組所有動物膀胱可見黏膜下層炎性細胞浸潤，20%的動物可見黏膜下層血管擴張充血；部分動物腎臟局部間質(zhì)內(nèi)可見炎性細胞聚集。鹽酸左氧氟沙星組只有20%的動物膀胱可見黏膜下層少量炎性細胞浸潤，其余動物膀胱組織結(jié)構(gòu)均未見異常；有1只動物腎臟可見少量炎細胞浸潤，其余動物腎臟組織結(jié)構(gòu)未見異常,見圖3、圖4。

表9 各組別病理學評分中各分值的動物數(shù)Table 9 The number of animals of eachpathological grade in different groups

注：采用卡方檢驗的分析方法進行統(tǒng)計分析。與假手術(shù)組相比，△△P<0.05；與模型對照組相比，**P<0.05

Note：Chi-square test was used for statistical analysis. Compared with the Sham group,△△P<0.05; Compared with the Model group,**P<0.05

圖3 慢性尿路感染大鼠膀胱病理學結(jié)果(×100)——200 μmFig.3 The bladder histopathological results of chronic urinary tract infected rats

圖4 慢性尿路感染大鼠腎臟病理學結(jié)果(×100)——200 μmFig.4 The kidney histopathological results of chronic urinary tract infected rats

3 討論

任何藥物的開發(fā)，都必須在人類疾病動物模型上確認有效，才能以人作為無危害的受試者。因此，在進行慢性尿路感染(CUTI)的藥物開發(fā)時，對CUTI動物模型的動態(tài)變化研究也應(yīng)成為其研究的重點之一。立足于此，本文根據(jù)CUTI的發(fā)病特點[6, 9-11](女性發(fā)病率高、大腸桿菌為主要病原菌，上行感染為常見的感染類型)，采用大腸桿菌逆行感染法成功建立雌性大鼠的CUTI模型[10, 12]，并首次對疾病模型的發(fā)展情況進行動態(tài)監(jiān)測。

在以往的造模方法中，大多采用逆行感染法進行造模，但對于保證大腸桿菌在尿路中的黏著時間缺乏足夠的重視，沒有為大腸桿菌提供良好的黏著條件。在本實驗中，我們采用擠壓膀胱排空尿液，注意造模前后的禁水以及采用夾閉尿道口的方法為大腸桿菌提供良好的尿路黏著環(huán)境，以利于成功建模。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，造模后在第14、21天的監(jiān)測點，模型動物體溫上升最為明顯，尿液細菌數(shù)也在這兩個監(jiān)測點達到最大值，與之對應(yīng)的血液白細胞數(shù)在第7、14、21天這三個監(jiān)測點與假手術(shù)組存在顯著差異。建模第30天結(jié)束實驗時發(fā)現(xiàn)，模型動物腎臟和膀胱菌數(shù)大幅度升高，病理檢查結(jié)果顯示模型動物均出現(xiàn)膀胱炎，黏膜充血，部分動物出現(xiàn)腎炎，且病理評分高分值的動物數(shù)顯著增多，具有明顯的尿路感染特征。根據(jù)感染部位的不同，CUTI可分為上尿路感染，主要指的是腎盂腎炎，以及下尿路感染，包括尿道炎和膀胱炎[1]。因此，從上述的動態(tài)監(jiān)測結(jié)果及病理診斷結(jié)果可判斷，在本實驗的造模條件下，可建立具有明顯下尿路感染癥狀和具有一定的上尿路感染癥狀的動物模型，此模型的疾病嚴重程度屬于中等程度，且在這模型中，CUTI動物的發(fā)病最高峰主要集中在細菌接種后的第14～21天，這段時間炎癥發(fā)生明顯，疾病表現(xiàn)會最為突出，同時也最適合對藥物進行藥效學觀察，但是，藥物的干預則應(yīng)在這段時間之前進行。此外，為證明此模型是否適合用于藥效學研究，本實驗同時設(shè)置了鹽酸左氧氟沙星干預組，實驗過程發(fā)現(xiàn)，給予抗生素干預，CUTI動物無論在感染菌數(shù)還是組織炎癥上，均有好轉(zhuǎn)趨勢。

在進行藥效研究時，用于初步藥效學觀察的動物疾病模型建模不宜過于嚴重，否則容易掩蓋藥效，從而錯誤地淘汰了具有潛在開發(fā)價值的藥物。在本實驗的造模條件下，建立的是中等程度的慢性尿路感染動物模型，可用于藥物的初步藥效學篩選，同時本實驗還提供了模型的動態(tài)變化檢測結(jié)果，為何時進行藥物干預、藥效觀察提供了實驗基礎(chǔ)上的參考。