原亞莉，賀桂芳，馬 莉，張浩軍，卞美璐，楊文艷，張 媛

（1.清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100016；2.中日友好醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100029；3.中日友好臨床醫(yī)學(xué)研究所 藥理室；4.北京大學(xué)中日友好臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029）

持續(xù)的高危型人乳頭瘤病毒感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的主要原因[1，2]。目前常用的HPV 病毒檢測(cè)為HPV-DNA 分型檢測(cè)，2012年指南提出HPV 16/18 型感染者應(yīng)直接行陰道鏡檢查，然而大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為一過性感染致癌的可能性小，且其他高危型別中也有可能發(fā)展為宮頸癌的高危人群，因此HPV 分型檢測(cè)不能區(qū)別一過性感染和真正發(fā)生宮頸癌的高風(fēng)險(xiǎn)人群。在HPV 病毒基因組中，E6/E7 基因是主要的致癌基 因[3～5]，E6/E7 蛋白在初始感染階段即一過性感染階段只有低水平表達(dá)，在持續(xù)感染階段有較高水平表達(dá)[6]。本研究擬通過E6/E7 蛋白檢測(cè)來篩選出真正可能發(fā)展為宮頸癌的高風(fēng)險(xiǎn)人群，提高病變的檢出率，避免不必要的陰道鏡檢查帶來的創(chuàng)傷。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2015年11月～2017年11月期間中日友好醫(yī)院婦產(chǎn)科宮頸病變門診就診及住院的進(jìn)行液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)（LCT）、高危型HPV-DNA 檢測(cè)以及于陰道鏡檢查下行活體組織病理檢查或?qū)m頸錐切病理檢查的400 例患者。根據(jù)組織病理學(xué)結(jié)果分為正常/炎癥45 例，CIN-1 91 例，CIN 2-3 220例，宮頸癌44 例?；颊吣挲g22～71 歲，平均年齡40.32 歲。所有患者均知情同意。

從上述400 例選取于門診就診的53 例HPV 16/18 型陽性患者的液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)剩余標(biāo)本重新制片進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，另取10 例HPV陰性的正常人作為對(duì)照，檢測(cè)E6 和E7 蛋白的表達(dá)水平，分析其表達(dá)水平與組織病理學(xué)結(jié)果符合情況。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液基細(xì)胞學(xué)檢查

于宮頸鱗柱交界部位取材，放入專用的保存液中，在去除血液、粘液以及大多數(shù)炎性細(xì)胞后，制片染色，通過顯微鏡閱看載玻片分析結(jié)果。細(xì)胞學(xué)診斷采用TBS（The Bethesda system）分級(jí)系統(tǒng)。

1.2.2 人乳頭瘤病毒DNA 檢測(cè)

采用熒光PCR 技術(shù)對(duì)上述400 例患者進(jìn)行HPV分型檢測(cè)。按照高危人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)試劑盒（上海之江生物科技股份有限公司）提供的操作要求進(jìn)行病毒核酸提取和擴(kuò)增試劑的配制，可檢測(cè)出13 種高危型亞型及2 種低危型亞型。

1.2.3 陰道鏡活組織檢查

陰道鏡檢查前應(yīng)排除陰道毛滴蟲、淋病奈瑟菌等感染?；颊呷“螂捉厥?，窺器暴露宮頸，用宮頸鉗取醋白上皮或碘不著色區(qū)等多點(diǎn)部位送病理檢查。根據(jù)病變的嚴(yán)重程度將病理診斷分為：慢性宮頸炎、CIN 1 級(jí)、CIN 2 級(jí)、CIN 3 級(jí)及浸潤性癌。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

采取上述所選53 例患者和10 例正常人的LCT 剩余保存液，重新制片行免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)E6/E7 蛋白。HPV l6/18 E6 單克隆抗體（稀釋濃度：1：100）、HPV 16 E7 單克隆抗體（稀釋濃度：1：400）均購自Abcam 公司。用已知陽性的宮頸癌病例作陽性對(duì)照，用PBS 替代一抗作陰性對(duì)照。陽性細(xì)胞： 細(xì)胞核中或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕色染色視為E6/E7 蛋白陽性。確定陽性標(biāo)準(zhǔn)：任選10 個(gè)高倍鏡視野，按陽性細(xì)胞所占上皮細(xì)胞的百分比劃分。分為4 組：陰性，0～9%；輕度，10%～25%；中度，26%～50%；重度，＞51%陽性細(xì)胞。至少需要2位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生雙盲法觀察，陽性細(xì)胞率≥10%者為陽性。

1.3 觀察指標(biāo)

以宮頸組織病理學(xué)診斷結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，分析HPV 各亞型的分布情況，觀察HPV E6 和E7蛋白的表達(dá)水平與組織病理學(xué)結(jié)果符合情況。在不同級(jí)別宮頸病變（≤CIN1 組與≥CIN2 組之間）比較HPV-DNA 檢測(cè)與E6/E7 蛋白檢測(cè)的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 年齡分布

以宮頸組織病理學(xué)診斷結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，CIN1及以上者視為陽性。陽性355 例：年齡＜30 歲53例（14.9%）；30～39 歲133 例（37.5%）；40～49 歲89例（25.1%）；50～59 歲57 例（16.1%）；≥60 歲23例（6.5%）。可知宮頸上皮內(nèi)病變發(fā)病高峰在30～39 歲。其中宮頸癌患者44 例：年齡＜30 歲4 例（9.1%）；30～39 歲8 例（18.2%）；40～49 歲11 例（25.0%）；50～59 歲14 例（31.8%）；≥60 歲7 例（15.9%）。宮頸癌發(fā)病高峰在50～59 歲。

2.2 HPV 各亞型的分布情況

HPV 陰性的患者中，組織病理學(xué)為正?；蜓装Y者占31.3%（10/32）； 感染HPV-16 型的患者中，病理診斷為高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌者（≥CIN 2）占87.9%（145/165），感染HPV-18 型的患者中，病理診斷為高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌者占70.8%（17/24），最低的亞型為HPV-66 20.0%（5/25）。在炎癥、CIN 1 中HPV-16/18 型感染所占的比例較低；在CIN 2-3 中，HPV-16 型感染占50.4%，HPV-18 型感染占4.7%；在宮頸癌患者中，HPV-16 型占63.4%，HPV-18 型占14.6%。本研究資料得出78.0%的宮頸癌是由HPV-16/18型引起的，9.8%（4/41）由HPV 其他型別引起。在所有患者中，HPV 各亞型感染率從高到低依次為16＞52/58＞56/51/31/66/18（見表1）。因400 例患者中大部分為住院患者，所以并不是在HPV 陰性患者中5/32 會(huì)致宮頸癌。一般從宮頸上皮內(nèi)病變發(fā)展為浸潤癌需10～15年，且宮頸癌5年存活率低。按人次來統(tǒng)計(jì)，因有部分混合型感染的患者，所以總計(jì)人數(shù)大于400 例。

2.3 HPV E6 和E7 蛋白的表達(dá)水平與組織病理學(xué)結(jié)果符合情況

10 例正常人的HPV（-），E6/E7 蛋白也為陰性。組織病理診斷為炎癥或CIN1 的15 例患者中，E6 蛋白的陽性率為20.0%，E7 蛋白的陽性率為26.7%；病理診斷為CIN 2-3 或癌癥的38 例患者中，E6 蛋白的陽性率為71.1%，E7 蛋白的陽性率為84.2%。研究結(jié)果顯示，隨著病變級(jí)別的增加，HPV E6/E7 蛋白的陽性表達(dá)率也逐漸增加，在不同級(jí)別宮頸病變（≥CIN 2 組與≤CIN 1 組）間表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）（見表2～4）。

E6 蛋白檢測(cè)高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌（≥CIN 2）的靈敏度、特異度、陽性及陰性預(yù)測(cè)值分別為71.1%、80.0%、90.0%、52.2%；E7 蛋白的靈敏度、特異度、陽性及陰性預(yù)測(cè)值分別為84.2%、73.3%、88.9%、64.7%（見表5）。LCT 檢測(cè)高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌的靈敏度、特異度、陽性及陰性預(yù)測(cè)值分別為63.2%（24/38）、86.7%（13/15）、92.3%（24/26）和48.1%（13/27）。HPV-DNA 檢測(cè)的陽性預(yù)測(cè)值為71.7%（38/53）。結(jié)果表明，HPV E6 蛋白和E7 蛋白檢測(cè)的靈敏度與陰性預(yù)測(cè)值均高于LCT 檢測(cè)，陽性預(yù)測(cè)值均高于HPV-DNA 檢測(cè)（分別為90.0% vs 71.7%，88.9% vs 71.7%）。

表1 不同組織病理學(xué)病變中HPV 各亞型的分布情況（n）

表2 不同組織病理學(xué)檢查結(jié)果的患者HPV E6 蛋白的陽性表達(dá)情況（n）

表3 不同組織病理學(xué)檢查結(jié)果的患者HPV E7 蛋白的陽性表達(dá)情況（n）

表4 HPV E6/E7 蛋白在不同級(jí)別宮頸病變中的表達(dá)水平 n（%）

表5 HPV-16/18 型陽性患者中E6、E7 蛋白表達(dá)對(duì)高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

宮頸癌及癌前病變的篩查方法主要是LCT與HPV 檢測(cè)，目前常用的HPV 檢測(cè)方式是HPV-DNA 檢測(cè)。本研究結(jié)果顯示：感染HPV 16型的患者中，病理診斷為高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌者（≥CIN 2）占87.9%；感染HPV 18 型的患者中，占70.8%。因此，HPV 16/18 型與宮頸癌關(guān)系尤為密切。2012年指南指出HPV 16/18 型感染者直接行陰道鏡檢查，但是一過性感染導(dǎo)致宮頸癌的可能性小，HPV-DNA 整合入宿主DNA 是宮頸癌發(fā)生的關(guān)鍵步驟[7，8]。

HPV-DNA 檢測(cè)是基于L1 片段（查病毒），而L1 不是致癌基因，且在整合過程中容易發(fā)生缺失，故以L1 區(qū)為目標(biāo)檢測(cè)物的HPV 檢測(cè)存在假陰性風(fēng)險(xiǎn)[9]，不能區(qū)分一過性感染和真正發(fā)展為癌的高風(fēng)險(xiǎn)人群。E6/E7 才是使細(xì)胞發(fā)生永生化的致癌基因，其編碼的E6 和E7 蛋白通過降解p53 抑癌蛋白和干擾pRB 蛋白，破壞細(xì)胞衰老、凋亡和遺傳穩(wěn)定性的正常調(diào)控，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生永生化[10～13]。故而很多學(xué)者提出E6/E7 基因是檢測(cè)高危型人乳頭瘤病毒的關(guān)鍵靶點(diǎn)[14，15]，其可直接檢測(cè)宮頸病變，而不僅僅是檢測(cè)HPV 病毒感染。

本研究結(jié)果顯示53 例HPV 16/18 型感染的患者中，E6 蛋白在炎癥、CIN 1、CIN 2-3 和宮頸癌中的陽性表達(dá)率分別為0%、37.5%、64.0%、84.6%，E7 蛋白的陽性表達(dá)率分別為14.3%、37.5%、80.0%、92.3%。隨著病變級(jí)別的增加，HPV E6/E7 蛋白的陽性表達(dá)率逐漸增加，不同級(jí)別宮頸病變（≤CIN 1 組比≥CIN 2 組）之間的表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。HPV E6 蛋白和E7蛋白檢測(cè)的靈敏度與陰性預(yù)測(cè)值均高于LCT 檢測(cè)，與Zhang 等[16，17]研究結(jié)果相符。HPV E6、E7 蛋白檢測(cè)的陽性預(yù)測(cè)值（90.0%、88.9%）均高于HPV-DNA 檢測(cè)（71.7%）。本研究中，在高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌（≥CIN 2）中，E6 蛋白的陽性率為71.1%，E7 蛋白的陽性率為84.2%，說明E6/E7 蛋白在診斷和預(yù)測(cè)高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌方面具有重要的參考價(jià)值。

因此，建議臨床行LCT 檢測(cè)或陰道鏡時(shí)，進(jìn)行E6/E7 蛋白檢測(cè)，將其作為一個(gè)篩查的重要指標(biāo)。本研究所選取的研究對(duì)象有限，有待深入研究進(jìn)一步加以證實(shí)。