馬澤寧

（山西省飼料獸藥監(jiān)察所，太原 030027）

0 引言

乳制品是我國(guó)社會(huì)大眾的重要營(yíng)養(yǎng)食品，乳制品中抗生素含量超標(biāo)，會(huì)損害消費(fèi)者的身體健康。同時(shí)乳制品抗生素殘留，還會(huì)進(jìn)一步降低我國(guó)乳制品在國(guó)際上的地位，引起貿(mào)易摩擦。采取有效的檢測(cè)技術(shù)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)乳制品中殘留的抗生素就成為現(xiàn)階段需要重點(diǎn)解決的問(wèn)題。

1 殘留抗生素種類

第一，β-內(nèi)酰胺類抗生素。這些抗生素應(yīng)用較為廣泛的主要有青霉素類抗生素和頭孢霉類抗生素，這2種抗生素經(jīng)常用于牛等家畜的臨床疾病治療，主要會(huì)殘留在牛乳中。第二，四環(huán)素類抗生素。應(yīng)用較為廣泛的主要有四環(huán)素、金霉素、土霉素和鹽酸多西環(huán)素，這類抗生素屬于廣譜抗菌的抗生素。第三，氨基糖苷類抗生素。這類抗生素中比較常見(jiàn)的主要有慶大霉素、鏈霉素、新霉素和壯觀霉素等，同樣都是奶牛疾病治療中經(jīng)常使用的抗生素。第四，氯霉素類抗生素。這類抗生素主要涉及到氯霉素、甲砜霉素和富甲砜霉素。這類抗生素由于副作用和毒性較大，嚴(yán)格限制使用量。第五，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。這類抗生素主要有紅霉素、林可霉素、螺旋霉素和鹽霉素等。第六，磺胺類抗生素。磺胺類抗生素是奶牛養(yǎng)殖中使用最頻繁的一類抗生素之一，這類抗生素主要有磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲嘧啶和磺胺嘧啶等。

2 檢測(cè)原理與技術(shù)

2.1 檢測(cè)原理

傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的原理是基于乳制品中的抗生素能夠?qū)δ承┪⑸锂a(chǎn)生一定的抑制作用，通過(guò)擴(kuò)散或渾濁度的比較，對(duì)抗生素種類和含量作出大致的判斷。在乳品中，抗生素濃度越高，某些微生物生長(zhǎng)的異質(zhì)性就越強(qiáng)，生長(zhǎng)出來(lái)的菌落也就越小。而免疫檢測(cè)法是基于抗生素抗體的一種檢測(cè)方法。在動(dòng)物體內(nèi)，應(yīng)用含量超標(biāo)的抗生素后，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激變化，在體內(nèi)形成抗體，通過(guò)使用抗原和抗體進(jìn)行特異性反應(yīng)，確定抗生素的種類和含量。該種檢測(cè)方法是利用細(xì)胞質(zhì)因子專一性的特點(diǎn)，能夠和某些抗生素進(jìn)行特異性反應(yīng)，通過(guò)整個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中酶活性的變化和基質(zhì)電流的變化，判斷檢測(cè)物種是否存在抗生素，同時(shí)還能夠?qū)股氐臐舛茸鲞M(jìn)一步的推斷。最終達(dá)到提高檢測(cè)效率，縮小資金和成本投入的目的。而高效液相色譜和質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)乳制品中抗生素濃度和含量種類的定量定性分析判斷，這2種方法主要是基于它們具有測(cè)定痕量物質(zhì)的優(yōu)越性。

2.2 檢測(cè)技術(shù)

結(jié)合FDA獸醫(yī)學(xué)中心的相關(guān)規(guī)定，乳品中殘留抗生素檢測(cè)技術(shù)，要確保敏感性強(qiáng)、特異性高?？股氐臋z測(cè)方法，要想被認(rèn)可，并形成統(tǒng)一的技術(shù)規(guī)范，對(duì)其檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)值有很高的要求。某種檢測(cè)技術(shù)的最低檢測(cè)范圍應(yīng)該控制在95%以上。在對(duì)某種檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，主要涉及以下幾個(gè)方面。

第一，對(duì)檢測(cè)技術(shù)的敏感性和特異性進(jìn)行判斷。在進(jìn)行特異性判斷過(guò)程中，所選擇的乳制品要絕對(duì)不含有抗生素，體細(xì)胞數(shù)量要大于106個(gè)/mL，檢測(cè)結(jié)果為陰性，由此能夠證明，所選擇的檢測(cè)技術(shù)具有很好的特異性。在進(jìn)行抗生素敏感性檢測(cè)中，在鮮奶中添加MRL水平的抗生素，最終得出的結(jié)果是陽(yáng)性。第二，乳品中抗生素殘留最低濃度值檢測(cè)。在進(jìn)行最低濃度值測(cè)定中，會(huì)采集60個(gè)左右的樣本進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)對(duì)60個(gè)樣本進(jìn)行全面檢測(cè)，根據(jù)相應(yīng)的濃度變化，繪制出檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，反應(yīng)乳品中最低濃度值。第三，評(píng)價(jià)因素。要選擇含有內(nèi)毒素，且體細(xì)胞含量在2×106～6×106 個(gè)/mL的乳品，要確保特異性結(jié)果高達(dá)90%以上。第四，現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)。利用該種檢測(cè)技術(shù)，在各個(gè)地區(qū)不同規(guī)模的養(yǎng)殖場(chǎng)，不同抗生素類型的奶樣進(jìn)行全面檢測(cè)，將得到的檢測(cè)結(jié)果和液相色譜分析法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)照，查看兩者之間的差異性[1]。

2.2.1 微生物檢測(cè)法

微生物檢測(cè)法是我國(guó)鮮奶抗生素殘留應(yīng)用最為常見(jiàn)的一種檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法的原理是基于抗生素對(duì)某些微生物具有抑制作用。具體操作包含以下幾個(gè)方面：在脫脂乳培養(yǎng)基上接種單菌種，7 ℃保溫箱內(nèi)培養(yǎng)，15 h后選擇培養(yǎng)物，按照1∶1的比例進(jìn)行充分稀釋，作為待檢溶液。將得到的溶液，在80 ℃環(huán)境下水浴，加熱5 min，再冷卻到37 ℃，然后向其中加入事先制備好的菌液，混合均勻后，按照上述的加熱標(biāo)準(zhǔn)，再繼續(xù)加熱2 h，并向其中加入指示劑，按照上述溫度繼續(xù)加熱30 min，如果整個(gè)溶液的顏色變成紅色，則表明乳品中不存在抗生素，抗生素殘留水平在該種檢測(cè)方法的最低濃度以下；如果顏色不變，則表示待檢溶液中存在兩個(gè)抗生素，顯示為陽(yáng)性。微生物檢測(cè)法在檢測(cè)乳汁中青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素等方面具有較強(qiáng)的靈敏性[2]。該種方法具有操作簡(jiǎn)便，費(fèi)用低，作用時(shí)間較長(zhǎng)等特點(diǎn)。菌液制備是該種檢測(cè)方法成功的關(guān)鍵。

2.2.2 戴爾沃檢測(cè)法

戴爾沃檢測(cè)法同樣屬于微生物檢測(cè)法范疇。該種方法主要利用嗜熱芽孢菌，通過(guò)2～3 h的培養(yǎng)后，會(huì)產(chǎn)生酸，而產(chǎn)生的酸會(huì)因?yàn)橹甘緞┓纸舛庶S色。具體操作方法如下：在無(wú)菌環(huán)境下，將相應(yīng)的指示劑放入潔凈試管內(nèi)，然后向試管內(nèi)加入待檢乳品，恒溫箱內(nèi)64 ℃培養(yǎng)3 h，觀察整個(gè)反應(yīng)溶液顏色的變化情況。如果在試管底部，有超過(guò)2/3的固體介質(zhì)呈現(xiàn)黃色，則可判定為陰性；如果變成紫色，則可判定為陽(yáng)性。該種檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間短，成本低的特點(diǎn)。

2.2.3 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法

該種方法的基本操作是將待檢的乳樣放入到試管中，混合均勻，加熱樣品和檢測(cè)板，作用5 min。向樣品孔中加入待檢乳汁，當(dāng)激活圓環(huán)開(kāi)始退卻時(shí)，按Snap鍵，作用10 min后，使用讀數(shù)儀器讀取并打印結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果小于1.05 h為陰性，大于1.05 h為陽(yáng)性，該種方法普遍應(yīng)用到β-內(nèi)酰胺類多種抗生素檢測(cè)。該種檢測(cè)方法操作時(shí)間短，在10 min以內(nèi)即可以判斷出乳汁中β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、磺胺類等抗生素的殘留量[3]。

2.2.4 現(xiàn)代儀器分析法

現(xiàn)代儀器分析法主要是利用抗生素分子中基因所具有的特殊反應(yīng)或理化特性，通過(guò)利用現(xiàn)代分析儀器，對(duì)抗生素殘留情況進(jìn)行精確化分析的一種方法，如色譜法、熒光法、色譜質(zhì)譜聯(lián)用法，其中應(yīng)用最為廣泛的是色譜法。色譜法主要有氣相色譜檢測(cè)法、高效液相色譜檢測(cè)法、反相高效液相色譜法等，它主要應(yīng)用色譜理論，通過(guò)使用高精度的檢測(cè)儀器對(duì)乳品中的抗生素進(jìn)行精確檢測(cè)，具有檢測(cè)速度快、檢測(cè)效率高、操作自動(dòng)化的特點(diǎn)。整個(gè)檢測(cè)流程包含樣品提取、脫蛋白處理、離心處理、層析柱凈化、衍生化等步驟。該種方法能夠詳細(xì)具體的檢測(cè)出抗生素的具體含量。利用現(xiàn)代儀器分析法，具有快速分離、檢測(cè)效率高、自動(dòng)化程度高的特點(diǎn)，能夠精確檢測(cè)出抗生素的含量，靈敏性高，但整個(gè)操作過(guò)程較為繁雜，消耗時(shí)間較長(zhǎng)，同時(shí)在操作中還需要相應(yīng)的昂貴儀器設(shè)備和試劑，通常在大型實(shí)驗(yàn)室使用，不適合在基層快速檢測(cè)應(yīng)用。