李玉娟

（包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014035)

本研究基于隱孢子蟲的18S rRNA的PCR技術(shù)調(diào)查犢牛隱孢子蟲的感染情況，并利用多位點(diǎn)分型技術(shù)對(duì)分離獲得的分離株進(jìn)行基因分型，進(jìn)一步評(píng)估人獸共患風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料

1.1 樣品

2017年3月在包頭郊區(qū)的4個(gè)牛場(chǎng)共采集50份犢牛糞便進(jìn)行隱孢子蟲感染，樣品保存于重鉻酸鉀溶液（2.5%）。

1.2 試劑

2íTaq Master Mix（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；糞便基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；DL 2000 DNA Marker（寶生物工程有限公司產(chǎn)品）。

1.3 引物

參照Xiao等設(shè)計(jì)的套式PCR引物，擴(kuò)增隱孢子蟲的18S基因。參照Feng等應(yīng)用MLST對(duì)本試驗(yàn)中所獲得的分離株的小衛(wèi)星基因位點(diǎn)MS1、MS2、MS3和MS16進(jìn)行擴(kuò)增。引物由上海生工合成。

2 方法

2.1 提取樣品DNA

參照糞便基因組DNA提取試劑盒說明書，提取50份犢牛糞便樣品基因組DNA。

2.2 PCR反應(yīng)

反應(yīng)體系為：12.5 μL 2íTaq Master Mix，上下游引物各 1 μL，2 μL 模板 DNA， 雙蒸水補(bǔ)齊至 25 μL。 擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 45 s，退火 45 s，72℃延伸 1 min， 共 35循環(huán)；72℃延伸 10 min。PCR陽性產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2.3 測(cè)序及進(jìn)化樹分析

將第二輪PCR陽性產(chǎn)物送至金唯智生物科技（北京）有限公司進(jìn)行測(cè)序。為了確定隱孢子蟲的種，基于18S基因，利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，復(fù)制數(shù)為1000。將MS1、MS2、MS3和MS16的測(cè)序結(jié)果直接在NCBI中BLAST檢索，確定其基因型。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

50份提取的DNA樣品中，只有8份樣品成功擴(kuò)增出約850 bp的目的條帶，且無非特異性擴(kuò)增，

3.2 隱孢子蟲的進(jìn)化樹分析

8份樣品有效長度均為830 bp。為了進(jìn)一步確定隱孢子蟲的種，以NJ法構(gòu)建分子進(jìn)化樹，其中5個(gè)隱孢子蟲分離株（S1、S2、S3、S4、S5）與安氏隱孢子蟲（登錄號(hào)：KF271478）位于一枝，而另外3個(gè)分離株（S6，S7，S8）與牛隱孢子蟲（AY741305）聚為一枝，并且具有較高的節(jié)點(diǎn)值（100和 88），這一結(jié)果表明S1、S2、S3、S4、S5 為安氏隱孢子蟲，S6，S7，S8 為牛隱孢子蟲。

4 討論

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道牛可感染7種隱孢子蟲，它們分別是微小隱孢子蟲，牛隱孢子蟲，安氏隱孢子蟲，瑞氏隱孢子蟲，人隱孢子蟲，貓隱孢子蟲和豬隱孢子蟲。本研究隱孢子蟲的感染率為16%，且只檢測(cè)到牛隱孢子蟲和安氏隱孢子蟲，其中安氏隱孢子蟲為優(yōu)勢(shì)種，西北地區(qū)氣候較干燥，不利于隱孢子蟲的生存和傳播，且本試驗(yàn)所研究的犢牛是圈舍內(nèi)飼養(yǎng)，與外界環(huán)境接觸較少，這些因素對(duì)該地區(qū)隱孢子蟲的發(fā)育和傳播可能產(chǎn)生一定的影響。本研究中沒有檢測(cè)到人獸共患的隱孢子蟲-微小隱孢子蟲，這可能與采樣的數(shù)量或地點(diǎn)有關(guān)，為了進(jìn)一步調(diào)查包頭市牛感染隱孢子蟲的情況和評(píng)估人獸共患風(fēng)險(xiǎn)，須在不同的區(qū)域采集更多的樣品。