◎ 仉 薇，吳 鑫，章志超

（江西省食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，江西 南昌 330001）

諾如病毒是全球急性胃腸炎流行和散發(fā)病例最常見的原因，也是食源性胃腸炎的主要原因[1-2]。諾如病毒的感染性很強(qiáng)，很少的病毒量（小于100個(gè)病毒顆粒）即可造成感染，直接通過(guò)糞-口途徑傳播，除了導(dǎo)致幼兒、免疫功能低下患者和老年人的高感染率、高死亡率外，還造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅在美國(guó)就有2 100萬(wàn)例病例，每年有70 000例住院和800例死亡[4]，我國(guó)2006—2013年全國(guó)諾如病毒腹瀉疫情報(bào)告數(shù)也逐年上升，共報(bào)告56起，發(fā)病4 979例，平均每起89例病例[5]。其暴發(fā)通常與貝類或新鮮制備的蔬菜、水果沙拉有關(guān)，一般是由于感染的糞便污染了水或者源于感染的食品處理者[6]。

1 諾如病毒的結(jié)構(gòu)及多樣性

諾如病毒以前被稱為諾瓦克樣病毒，1972年美國(guó)學(xué)者Kapikian首先用免疫電鏡技術(shù)從胃腸炎患者的糞便樣本中檢出了該病毒，并且正式定名為諾如病毒[7]。諾如病毒屬于杯狀病毒科，諾如病毒屬，直徑通常在27～37 nm，無(wú)囊膜。是基因組長(zhǎng)度在7.5～7.7 kb左右的單鏈RNA病毒，有3個(gè)開放閱讀框，ORF-1長(zhǎng)約5 kb，ORF-2長(zhǎng)約1.8 kb，ORF-3長(zhǎng)約0.6 kb，分別編碼非結(jié)構(gòu)多聚蛋白，主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1和強(qiáng)堿性微小結(jié)構(gòu)蛋白[8]。依據(jù)其基因特征，主要分為6個(gè)基因型GⅠ-GⅥ，每個(gè)基因型又包含不同的基因亞型，其中GⅡ.4型占全世界流行的諾如病毒的70%～80%，主要引發(fā)人感染病毒性胃腸炎。諾如病毒易變異，單個(gè)病毒株之間的差異高達(dá)2.8%，基本每隔兩三年便會(huì)出現(xiàn)新的變異株，從而引發(fā)局部大的暴發(fā)流行。

2 諾如病毒的流行病學(xué)和暴發(fā)

目前，諾如病毒在全世界均廣泛流行，1995—2000年，85%以上的暴發(fā)性病毒性胃腸炎系諾如病毒所致[9]。美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心估計(jì)，美國(guó)每年有60%的急性胃腸炎是由諾如病毒感染引起的。我國(guó)在山西、北京、安徽、福州、武漢、廣州、廣西等地也先后發(fā)生諾如病毒感染性腹瀉疫情[10]。人類是人諾如病毒的唯一宿主，人群普遍易感，諾如病毒在不同年齡段均可造成感染，且諾如病毒感染在各種環(huán)境中均有報(bào)道，特別是生活區(qū)密集、共用餐飲設(shè)施和環(huán)境維護(hù)困難的地方（如養(yǎng)老院、學(xué)校、醫(yī)院、軍隊(duì)等）。諾如病毒最主要的傳播途徑是糞-口途徑，可通過(guò)被污染的食物或水引起人群胃腸炎散發(fā)甚至暴發(fā)。目前，估計(jì)由食物引起的諾如病毒感染胃腸炎可占50%。其中，牡蠣等貝類是最常見的引發(fā)諾如病毒感染的食物，由于牡蠣可以捕獲和富集大量諾如病毒顆粒，并且人們常常生食牡蠣，人吃了帶有大量諾如病毒的牡蠣，就有可能感染諾如病毒，如果此時(shí)在一個(gè)較為封閉的環(huán)境中就很有可能造成諾如病毒感染性胃腸炎，因而對(duì)于牡蠣中諾如病毒的快速檢測(cè)是非常有意義的[11]。

3 諾如病毒的臨床特點(diǎn)

諾如病毒的潛伏期在12～72 h，感染者表現(xiàn)為突然發(fā)病，主要癥狀為嘔吐和腹瀉，有些還伴有腹痛和發(fā)熱，平均癥狀持續(xù)時(shí)間在1.2～2.8 d[12]，在1～3 d有86.4%的患者癥狀消失，嚴(yán)重程度和年齡、是否患有合并癥以及免疫功能有一定關(guān)聯(lián)。諾如病毒感染還可表現(xiàn)為無(wú)癥狀感染，可在攜帶者糞便中檢測(cè)到諾如病毒，但是攜帶者卻沒有表現(xiàn)出常見的感染癥狀，這種情況在兒童中最為常見。諾如病毒的無(wú)癥狀排泄具有診斷意義，無(wú)癥狀攜帶者可以造成諾如病毒的散播，同時(shí)需要注意無(wú)癥狀攜帶者因其他原因引起的腹瀉被誤診為諾如病毒感染[13]。

4 諾如病毒的體外培養(yǎng)

在過(guò)去的40多年中，人們嘗試在支持多種病毒生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)物（如源自癌變組織的轉(zhuǎn)化細(xì)胞）以及轉(zhuǎn)化的腸上皮細(xì)胞及原代人類免疫細(xì)胞中培養(yǎng)人諾如病毒，但是均以失敗告終[14-15]。此外，諾如病毒是有物種特異性的，人諾如病毒只感染人類并導(dǎo)致人類患病，人諾如病毒并不在小鼠或其他小型模式動(dòng)物體內(nèi)繁殖擴(kuò)增，這極大地限制了諾如病毒疫苗的研究。直到2016年，Khalil Ettayebi的團(tuán)隊(duì)成功在源自人干細(xì)胞的類腸道組織培養(yǎng)物中培養(yǎng)了人諾如病毒，實(shí)現(xiàn)了諾如病毒的體外培養(yǎng)，并且揭示了有些人諾如病毒的復(fù)制依賴膽汁的存在，不同的人諾如病毒在不同腸段的腸上皮細(xì)胞復(fù)制。這一新的培養(yǎng)體系的建立，能夠幫助人們更進(jìn)一步深入研究諾如病毒的進(jìn)化、免疫及發(fā)病機(jī)制，并且有望用于促進(jìn)食品安全，以及新疫苗的研發(fā)等[16]。

5 諾如病毒的檢測(cè)

我國(guó)是水產(chǎn)品的養(yǎng)殖大國(guó)，也是水產(chǎn)品的出口和消費(fèi)大國(guó)。近年來(lái)，隨著世界各國(guó)對(duì)食品安全的重視，我國(guó)水產(chǎn)品出口屢屢遭受技術(shù)壁壘，美國(guó)和日本、歐盟等許多國(guó)家和地區(qū)對(duì)我國(guó)的水產(chǎn)品提出了諸多嚴(yán)格的限量指標(biāo)，其中一項(xiàng)規(guī)定是諾如病毒不得檢出[17]。諾如病毒在環(huán)境中生存能力強(qiáng)，感染劑量小，可以通過(guò)多種途徑傳播，因而對(duì)于其檢測(cè)技術(shù)要求較高。目前，主要的檢測(cè)方法有電鏡法、免疫學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法。

5.1 電鏡法

電鏡法分為直接電鏡法和免疫電鏡法。在國(guó)內(nèi)，方肇寅等首次用直接電鏡法發(fā)現(xiàn)了腹瀉病人大便樣品中的諾如病毒[18]。美國(guó)學(xué)者Kapikian在1972年用免疫電鏡法首次觀察到美國(guó)諾瓦克鎮(zhèn)腹瀉患者糞便中的諾如病毒[7]。電鏡法是諾如病毒檢測(cè)的經(jīng)典方法，但是該方法的缺陷明顯，諾如病毒在電鏡下的形態(tài)并不明顯，判斷依賴于檢測(cè)者的經(jīng)驗(yàn)，靈敏度較低，并且操作繁雜，需要專業(yè)人員操作，設(shè)備昂貴，無(wú)法廣泛普及，不適于臨床研究及大規(guī)模的普查。

5.2 免疫學(xué)檢測(cè)法

免疫學(xué)方法主要包括放射免疫法、生物素-親和素免疫法和酶聯(lián)免疫法。近年來(lái)，利用原核或真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)諾如病毒蛋白從而建立快速檢測(cè)方法不斷涌現(xiàn)。免疫法的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)較少，但是其靈敏度不高。

5.3 分子生物學(xué)檢測(cè)法

分子生物學(xué)方法包括常規(guī)PCR、巢氏PCR、熒光定量PCR等。熒光定量PCR現(xiàn)已成為諾如病毒診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，廣泛應(yīng)用于諾如病毒的檢測(cè)。但是，由于諾如病毒的多樣性，要設(shè)計(jì)出一對(duì)通用引物是該方法的難點(diǎn)；并且，由于熒光定量PCR系統(tǒng)的開放性，很容易發(fā)生交叉污染，造成假陽(yáng)性，對(duì)診斷造成干擾。隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，多重?zé)晒舛縋CR能同時(shí)診斷多種腸道病毒如諾如病毒、星狀病毒和輪狀病毒。該方法能用于低濃度的諾如病毒檢測(cè)，還能夠進(jìn)一步對(duì)病毒進(jìn)行分型，對(duì)諾如病毒流行病學(xué)的研究有重要意義[19]。

6 諾如病毒的預(yù)防與治療

若人們食用了被諾如病毒污染的食物，則易于引起諾如病毒的感染甚至暴發(fā)。以最常見的牡蠣為例，由于受污染的牡蠣暴發(fā)呈現(xiàn)不同的季節(jié)性，因而可以提前做好檢測(cè)工作，從而防患于未然，防止因食用牡蠣導(dǎo)致諾如病毒的暴發(fā)。另外，針對(duì)封閉或半封閉的環(huán)境，加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生管理以及增強(qiáng)個(gè)人衛(wèi)生意識(shí)是非常重要的[20]。

人諾如病毒感染一般具有自限性，因而臨床治療以對(duì)癥治療和支持療法為主，治療的關(guān)鍵在于針對(duì)腹瀉和脫水的補(bǔ)液治療，病情嚴(yán)重的患者還需要糾正酸中毒和電解質(zhì)代謝異常。由于還沒有特效的抗病毒藥物和疫苗，在這兩個(gè)領(lǐng)域也是涌現(xiàn)許多新成果。隨著越來(lái)越多諾如病毒蛋白結(jié)構(gòu)的解析，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬設(shè)計(jì)靶向的抗病毒藥物成為可能。研究發(fā)現(xiàn)，不同毒株的諾如病毒存在許多相似的保守結(jié)構(gòu)，通過(guò)對(duì)這些保守結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步探索，可能產(chǎn)生有效對(duì)抗諾如病毒毒株多樣性的抑制劑。迄今為止，已經(jīng)測(cè)試了主要靶向病毒蛋白的大量候選抑制劑，但是其活性通常較低，不能達(dá)到預(yù)期效果[21]。而在諾如病毒疫苗研究方面，主要焦點(diǎn)在于如何構(gòu)建能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較好免疫反應(yīng)、耐熱、耐酸的病毒樣顆粒。全球多個(gè)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開展了諾如病毒樣顆粒疫苗及亞單位疫苗的臨床前研究及臨床試驗(yàn)。

7 展望

諾如病毒在全球范圍造成了較重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，雖然人們?cè)诳共《舅幬锖鸵呙绲难邪l(fā)方面做了許多積極的嘗試，但是目前為止仍然沒有一種藥物用于預(yù)防諾如病毒的感染或臨床治療。這與針對(duì)腸道病原體的所有抑制劑一樣，與抑制劑能否被準(zhǔn)確地遞送至復(fù)制點(diǎn)并且能夠在腸道環(huán)境中穩(wěn)定發(fā)揮效用有關(guān)。除了在抗病毒藥物和疫苗方面仍需繼續(xù)探索外，諾如病毒細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的建立及人諾如病毒動(dòng)物模型的構(gòu)建也是今后發(fā)展的重點(diǎn)。這兩個(gè)系統(tǒng)的完善能夠幫助人們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)諾如病毒的特性，并且能夠給治療藥物的研發(fā)提供試驗(yàn)條件。在此之前，采取有效的檢疫和衛(wèi)生預(yù)防措施仍舊是控制諾如病毒感染的最好選擇。

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