李孟帆 李丹陽(yáng) 杜曉輝 趙奇 劉瑞霞

摘 要：本文通過(guò)選取優(yōu)質(zhì)無(wú)蟲(chóng)害的牡丹葉片，并提取不同時(shí)期葉片多糖提取液進(jìn)行比較，利用多糖溶液對(duì)酪氨酸酶活性的影響，通過(guò)對(duì)酪氨酸酶的抑制率來(lái)評(píng)價(jià)對(duì)黑色素的消除作用。研究表明，牡丹多糖溶液對(duì)黑色素具有抑制作用，并且隨著多糖溶液濃度的減少，其抑制率有所降低。

關(guān)鍵詞：牡丹多糖；黑色素；酪氨酸酶

中圖分類號(hào)：TQ658 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2018）22-0175-02

多糖是一種對(duì)維持人體生命活動(dòng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)有重要作用的生物大分子，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，具有調(diào)節(jié)人體免疫力、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、抗輻射等作用，還可在石油和化妝品工業(yè)中作為凝聚劑、潤(rùn)滑劑、保濕劑使用，同時(shí)也可在食品工業(yè)中作為果蔬涂膜劑和食品包裝應(yīng)用。目前，已有相關(guān)研究證明牡丹葉片多糖提取液可以有效消除羥自由基（-OH），且具有明顯的量效關(guān)系[1，2]。而我們想要探究多糖可以有效消除羥自由基的作用是否能夠有效減輕人們面部色斑？在社會(huì)壓力以及環(huán)境因素的影響下，許多愛(ài)美的年輕女性越來(lái)越注意自己面部色斑問(wèn)題。而色素的沉淀是人體皮膚呈現(xiàn)不同色斑的主要因素，但是色素沉淀及色斑產(chǎn)生的原因比較復(fù)雜，比如遺傳因素，內(nèi)分泌失調(diào)，環(huán)境污染，紫外線的照射等，不管是哪一種因素，歸根結(jié)底是由黑色素沉淀造成的，抑制黑色素的形成，或者提高皮膚的抗氧化能力成為我們研究的主要目標(biāo)。在化學(xué)合成工藝不斷進(jìn)步的時(shí)期，化妝品主要是含化學(xué)合成成分制品，但是接踵而來(lái)的是化學(xué)制品的毒性、過(guò)敏性、刺激性等問(wèn)題。于是人們開(kāi)始追求天然、無(wú)毒產(chǎn)品，這時(shí)候植物化妝品受到重視[3]。

牡丹葉片或者被堆積廢棄從而造成環(huán)境污染，或者被產(chǎn)地農(nóng)民用做低值薪柴使用，我們通過(guò)提取牡丹葉片多糖，對(duì)其進(jìn)行研究，增加了牡丹葉片的利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原理

檢測(cè)藥物抑制黑色素產(chǎn)生效果有代表性的試管內(nèi)測(cè)定方法主要分兩大類：酪氨酸酶試驗(yàn)法和用惡性黑素瘤細(xì)胞試驗(yàn)法，通常采用第一種方法[4]。因此，通過(guò)測(cè)定丹葉片多糖對(duì)酪氨酸酶的抑制作用來(lái)評(píng)價(jià)牡丹葉片多糖對(duì)黑色素的抑制能力[5，6]。

1.2 試驗(yàn)材料

牡丹葉片采收于鄭州師范學(xué)院實(shí)習(xí)實(shí)訓(xùn)基地。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 牡丹葉片多糖的提取

將牡丹葉片利用電恒溫鼓風(fēng)干燥箱進(jìn)行干燥處理，研磨制成粉末備用。取粉末10g，加入80%乙醇100ml，80℃恒溫水浴浸提30min，而后4000r/min離心20min收集上清液，將沉淀再次浸提，最后將兩次上清液混合。將10%三氯乙酸與上清液按1：12比例混勻，在室溫下靜置30min，再次在4000r/min條件下離心10min，棄掉蛋白質(zhì)沉淀，把上清液加入一定量無(wú)水乙醇，使上清液含醇量達(dá)到80%，最后將上清液濃縮到10ml，即得到牡丹葉片多糖溶液。

1.3.2 多糖濃度測(cè)定

采用苯酚硫酸法[7]制備葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定牡丹葉片多糖濃度。

1.3.3 酪氨酸酶活性測(cè)定

用蒸餾水將多糖溶液分別稀釋成原液濃度的10倍，20倍，30倍，40倍，50倍，并且以多糖濃度為0mg/ml時(shí)作為對(duì)照組。選取馬鈴薯代替酪氨酸酶，直接取馬鈴薯加入各反應(yīng)液中，將待測(cè)液設(shè)為A組，對(duì)照組設(shè)為B組，按表1所示依次加入。

按照上述表加入后，將其在室溫下靜置10min，迅速轉(zhuǎn)移至比色皿中，并在475nm處測(cè)OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線和多糖濃度

通常利用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定待測(cè)液的濃度，根據(jù)上述方法測(cè)出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度得出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

測(cè)出多糖溶液OD值分別為：4.482，4.832，4.768得出平均值為4.694。將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得出多糖濃度為7.593mg/ml。

2.2 不同濃度多糖溶液

將上述配成的不同稀釋倍數(shù)的多糖溶液得出的OD值如圖2所示。

可以看出隨著多糖溶液濃度減少，OD值也在減少，這可以看出隨著多糖溶液濃度與對(duì)酪氨酸酶抑制率成正相關(guān)關(guān)系。

2.3 抑制率

通過(guò)利用多糖溶液對(duì)酪氨酸酶的抑制作用來(lái)測(cè)出對(duì)黑色素的抑制作用，利用如下公式計(jì)算抑制率[8]：

抑制率I=（B-A/B）*100%

得出抑制率結(jié)果如圖3。由圖可以看出隨著多糖濃度的增加，其與酪氨酸酶的抑制率呈正相關(guān)關(guān)系。

3 總結(jié)與展望

該試驗(yàn)通過(guò)提取牡丹葉片多糖，并檢測(cè)牡丹葉片多糖溶液對(duì)酪氨酸酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)隨著牡丹多糖溶液濃度增加，其抑制作用也隨之增加。我們認(rèn)為以下幾點(diǎn)需要注意：第一，選取優(yōu)質(zhì)無(wú)蟲(chóng)害的牡丹葉片，并選取不同時(shí)期葉片多糖提取液進(jìn)行比較。第二，選擇合適的提取防范，增加多糖提取液的純度。第三，要注意與化妝品之間成分相容的問(wèn)題。相信隨著研究的不斷深入，牡丹葉片多糖提取液在化妝品中會(huì)得到廣泛使用。該試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行一些擴(kuò)展，將牡丹葉片和化妝品聯(lián)系起來(lái)是一種新的突破，但是該試驗(yàn)并未在人皮膚上試驗(yàn)，只是證明了其對(duì)黑色素形成會(huì)有抑制作用，將其應(yīng)用在以后的化妝品中還需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]李曉燕，劉志洪，蔡汝秀.黑色素對(duì)羥基自由基清除活性的研究[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003，（06）：1132-1136.

[2]李攀.天然活性化妝品發(fā)展概況[A].中國(guó)香料香精化妝品工業(yè)協(xié)會(huì).2004年中國(guó)化妝品學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C].中國(guó)香料香精化妝品工業(yè)協(xié)會(huì)：，2004：5.

[3]朱月，鐘尉，趙雪梅，畢曉丹.紫斑牡丹葉片多糖對(duì)羥自由基清除能力的比較[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（11）：341-342.

[4]毛培坤.化妝品功能性評(píng)價(jià)和分析方法.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1998，355-360.

[5]楊柳依，曹煜，魏羽佳，雷大衛(wèi).14種中藥提取成分對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用[J].中華皮膚科雜志，2003，（04）：32-34.

[6]沈放，王德斌.當(dāng)歸多糖對(duì)酪氨酸酶活性的影響[J].昆明師范高等專科學(xué)校學(xué)報(bào)，2005，（04）：61-62+67.

[7]朱月，畢曉丹，趙雪梅.“洛陽(yáng)紅”牡丹葉片多糖提取條件的研究[J].北方園藝，2011，（04）：149-151.

[8]李艷莉，鐘理，梁麗紅.6種中藥抑制酪氨酸酶活性的實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2002，（03）：129-131.