王磊，劉軍

(新疆大學生命科學與技術學院新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830046)

正常的生理情況下，人體的皮膚接觸適量紫外線，皮膚表皮基底層的黑色素細胞會產生黑色素以抵御紫外線，避免皮膚曬傷；但過量的紫外線照射不僅會導致表皮細胞的DNA損傷、基因突變、癌變以及免疫系統損傷和衰老等[1]，還會引起皮膚黑色素細胞過度增殖、凋亡及色素沉著紊亂等變化，從而引起皮膚色斑[2].在中老年人群中主要為老年斑、雀斑及黃褐斑等，而在青年人群中以雀斑、黃褐斑等色斑為多[3].

除紫外線照射外，女性雌激素水平紊亂也會引起皮膚色斑的形成，而雌激素水平的紊亂則與婦科疾病、化妝品使用、精神狀態(tài)、遺傳等因素密切相關[4,5].隨著現代人類對物質條件和幸福感的追求，女性對審美也有了更高的要求，面部皮膚色斑已成為影響女性美觀的主要原因之一.目前的研究表明黑色素合成、轉運和代謝等紊亂均可造成色素異常沉著[6]，因此對其形成機制探尋既有助于深入了解黑色素的發(fā)生機制，更有利于研究開發(fā)有效治療皮膚色斑的藥物和技術方法.

1 黑色素的種類、分布及合成

黑色素是由黑色素細胞合成的、一種氨基酸衍生的生物色素，屬于多元酚類聚合物，主要分棕/黑色的真黑素和紅/黃色的褐黑素兩種類型，具有保護皮膚的功能[7]，真黑素和褐黑素比例不同使皮膚顏色呈現一定差異性[8]，黑色素廣泛存在于表皮及眼睛等器官中[9].

現有的研究表明，黑色素的分布經歷四個階段：首先是黑色素小體形成，其次是黑色素小體成熟，隨后黑色素合成，最后含大量黑色素的黑色素小體被轉運[10].當黑色素細胞將黑色素小體轉運至鄰近的皮膚角質細胞時，將導致角質細胞產生生理生化變化，這時黑色素在皮膚角質細胞內沉積，皮膚就會呈現出顏色[11].黑色素的合成過程復雜（圖1），L-酪氨酸氧化是黑色素合成的起始步驟，酪氨酸酶（tyrosinase,TYR）、酪氨酸酶相關蛋白1（tyrosinase-related protein 1,TRP-1）和酪氨酸酶相關蛋白2（tyrosinase-related protein 2,TRP-2）是黑色素合成的重要限速因素[12]，TYR作為黑色素合成中的關鍵限速酶[13]，過表達時會造成黑色素異常沉著，形成皮膚色斑；另一方面，這些酪氨酸酶類表達量不足也將造成白化病、白癜風等疾病[14].TYR是一種Ⅰ型膜糖蛋白，以四聚體形式結合兩個Cu2+來發(fā)揮其生物功能，分子量128±6.4 kDa，亞基分子量32 kDa[15]，定位于黑色素小體膜上[16]，常常作為研究黑色素異常沉積的分子靶標.TYR可將L-酪氨酸氧化為多巴醌（dopamine quinone，DQ），DQ發(fā)生自氧化轉變?yōu)槎喟团c多巴色素，多巴色素的產物5,6-二羥基吲哚羧酸（5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid,DHICA）與5,6-二羥基吲哚（5,6-dihydroxyindole,DHI）進一步被氧化成真黑素.在半胱氨酸或谷胱甘肽的作用下，DQ還可形成半胱氨酰多巴進而合成褐黑素，真黑素和褐色素能夠形成混合色素.一般來說不同膚色黑色素細胞中的酪氨酸酶表達量無明顯差異[17]，對酪氨酸活性進行調節(jié)將成為影響黑色素合成的關鍵所在[18].而皮膚中的黑色素沉著與黑色素小體形成、黑色素穩(wěn)定合成、黑色素小體轉運及各階段相關基因的轉錄激活密切相關.

圖1 黑色素合成過程Fig 1 The process of melanin synthesis

2 成熟黑色素小體的形成

黑色素小體（melanosome）是黑色素細胞中淀粉樣纖維形成的紋狀體結構所構成的一種特化的膜結合細胞器，起源于黑色素細胞內的多囊泡內體（multivesicular endosomes/bodies，MVBs）.在黑色素小體形成階段，黑色素小體帶有管腔內膜泡（intraluminal vesicles，ILVs）的空泡結構[10]，該結構與溶酶體系統分離，并通過內吞作用攝入所需物質.在MVBs中，色素細胞特異性蛋白質前黑色素小體蛋白（premelanosome protein，PMEL）經歷水解加工，誘導沉積黑色素的原纖維產生.PMEL的蛋白水解片段經過CD63依賴性的分選至ILVs中，PMEL被加工并聚合，形成淀粉樣原纖維基質.研究顯示PMEL依賴性原纖維形成是黑色素細胞中黑色素小體生物發(fā)生過程中延長所必需的.隨著原纖維長度在黑色素小體上擴展和延伸，該過程也促進了未成熟的黑色素小體的延長.前黑色素小體蛋白17（premelanosome protein 17，PMEL 17）是參與黑色素小體纖維形成所必需的分子之一，能夠自主組裝形成黑色素小體紋狀體結構，并能夠維持黑色素小體內的環(huán)境平衡[19].研究表明PMEL 17會聚集在ILVs上，并隨ILVs的伸長而逐漸形成淀粉樣纖維，進而將ILVs送至MVBs周圍[20]，淀粉樣纖維大量聚集成片狀，最終形成橢圓形的黑色素小體.

在黑色素小體成熟階段，充滿片狀淀粉樣纖維的黑色素小體停止內吞作用[21]，TYR、TRP-1、TRP-2等酶類及溶酶體合成的相關細胞器復合物（biogenesis of lysosome-related organelles complexes-1/2/3，BLOC-1/2/3）、接頭蛋白（activator protein-1，AP-1）復合物被選擇性地轉運至黑色素小體中[22].黑色素瘤T細胞抗原（melanoma antigen recognized by T-cells 1，MART-1 或MLANA）是黑色素小體合成相關的跨膜蛋白，與PMEL 17相互作用形成復合體，影響著黑色素小體的穩(wěn)定性，并參與各種生理活動[19]；眼白化病基因（ocular albinism 1，OA1），其編碼的OA1蛋白是一種非典型G-蛋白偶聯受體，亦是一種黑色素小體膜蛋白，具有連接溶酶體和黑色素小體的作用[19].OA1基因能夠在成熟黑色素小體的膜中表達，能夠在前黑色素小體的內吞溶酶體中表達，影響其與PMEL 17的相互作用及黑色素小體的結構，OA1基因突變將會導致巨大畸形黑色素小體的產生，進而影響黑色素的合成[21].小鼠的某些基因，如P（pinyed dilute）基因、Slc24A5（potassium-dependent sodium-calcium exchanger）基因、Slc45A2基因等膜相關轉運蛋白基因，編碼黑色素小體膜上的離子交換蛋白，主要作用是調控黑色素小體Na+、K+、H+等陽離子濃度并共同維持黑色素小體內環(huán)境酸堿平衡[21].膜相關轉運蛋白（membraneassociated transporter protein，MATP）也能夠影響黑色素小體的成熟，主要會造成黑色素小體形狀異常、淀粉樣纖維形成紊亂，導致黑色素含量減少[19].以上研究表明，成熟黑色素小體的數量以及進入到黑色素小體的TYR、TRP-1等酪氨酸酶類活性與黑色素合成有著密切的相關性，對黑色素小體合成基因進行沉默或阻斷是減少黑色素合成的關鍵.

3 黑色素生物合成的信號通路

成熟的黑色素小體為黑色素合成代謝提供了必要場所，同時還受到諸多因素的影響.黑色素合成過程中，TYR是關鍵的限速酶，TRP-1和TRP-2則參與催化過程，對維持酪氨酸酶在黑色素小體膜上的穩(wěn)定性以及抑制未成熟黑色素細胞的死亡起著重要作用[20].

α-黑色素細胞刺激激素（α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH）是位于黑色素細胞膜上的13肽化合物，活性位點為4～10位氨基酸，參與黑色素的合成[23,24].α-MSH主要由表皮黑色素細胞和角質細胞通過自分泌和旁分泌方式產生[25].黑皮質激素-1受體（melanocortin-1 receptor，MC-1R）在黑色素細胞和角質細胞的胞漿和細胞膜表達，其與α-MSH結合后，通過G蛋白的作用誘導環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）增加，cAMP通過蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）發(fā)揮其信號分子作用[26]，引發(fā)小眼畸形相關轉錄因子（microphthalmia-associated transcription factor，MITF）以及TYR、TRP-1和TRP-2的表達上調，刺激黑色素合成[27].

Du等人報道α-MSH/MC-1R信號通路可促進真黑素的生成[28]；而刺鼠信號蛋白（agouti signal protein，ASIP）可誘導褐黑素的生成，并能將α-MSH誘導的MITF表達量下調，抑制MITF與TYR基因啟動子區(qū)M-box的結合，進而使TYR、TRP-1和TRP-2在這個過程的表達量減少，導致真黑素合成量減少[29].通過對α-MSH/MC-1R和ASIP兩者的調控，最終通過真黑素/褐黑素的比例，決定皮膚的總體色澤[30].

MITF是黑色素合成相關最重要的轉錄因子，其產物主要參與調控TYR、TRP-1和TRP-2的轉錄[31]，MITF自身表達也受多種信號分子調控，MITF啟動子區(qū)含有PAX3（paired box 3）、SOX 10（sex determining region Y box 10）、LEF1（lymphoid enhancer binding factor 1）和CRE（cAMP response element）等轉錄調控因子結合區(qū)[32].MITF還具有螺旋-轉角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）亮氨酸拉鏈結構DNA結合域，能夠調控黑色素細胞增殖、存活和色素的沉著，且磷酸化的MITF與M-box 結合可調節(jié)酪氨酸酶及其相關基因表達.PI3K/AKT（phosphatidylinositol 3-kinase/akt protein kinase B）途徑中磷酸化的GSK 3β（glycogen synthase kinase 3 beta）蛋白作用于MITF并磷酸化MITF，這有利于MITF與靶位點的結合，從而調控下游相關蛋白的表達[33].研究表明，PKA活化并激活相關cAMP響應元件結合蛋白（CRE-binding protein，CREB），從而進一步活化MITF并誘導黑色素相關基因TYR、TRP-1 和TRP-2的表達，催化L-酪氨酸形成黑色素[12,34].同時p38（p38 MAP kinase）可作用于上游刺激因子-1（upstream transcription factor-1，USF-1）影響CREB蛋白的磷酸化，磷酸化的CREB促進MITF的轉錄.其次，絲裂原活化蛋白激酶家族（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）的ERK（extracellular signal-regulated kinases）和JNK/SAPK（jun amino-terminal kinases/stress-activated protein kinases）也能通過調節(jié)CREB蛋白磷酸化來調控MITF的轉錄[35,36]，MAPKs/ERK信號通路可調節(jié)MITF的磷酸化作用，活化的ERK信號分子以間接或直接的方式抑制MITF磷酸化；且MAPKs/ERK的磷酸化可增加MITF的降解并封閉酪氨酸酶啟動子結合位點MITF M-box，有效抑制MITF 轉錄導致的黑色素合成減少[37,38].提示MAPKs家族蛋白的磷酸化激活對黑色素的合成具有雙向調節(jié)作用.

分泌型糖蛋白Wnt能夠通過經典和非經典途徑發(fā)揮黑色素合成的調控作用.經典的Wnt途徑引起黑色素細胞質中β-連鎖蛋白（β-catenin）的積累并進入細胞核內，進入細胞核的β-連鎖蛋白與LEF1相結合并作用于MITF啟動子位置，增強其轉錄表達水平，從而影響黑色素的合成[39].Wnt1和Wnt3A是參與調控經典Wnt通路中的重要分子，也是極大影響黑色素細胞行使功能的調控因子.對內皮素具有依賴性的Wnt1和Wnt3A參與黑色素細胞的發(fā)育，可促進黑色素細胞數量的増加，Wnt3A對成熟后的黑色素細胞的増殖有抑制作用.Wnt5A基因的過表達可以啟動非經典通路Wnt5A/ROR2，并激活在黑色素細胞樹突形成中起重要作用的Rho家族的GTP（guanosine-5’-triphosphate）酶，誘導黑色素細胞樹突形成，促進黑色素合成和轉運過程，從而增加色斑性疾病的發(fā)生概率.黑色素生物合成相關的信號途徑如圖2所示.

圖2 黑色素生物合成信號通路Fig 2 The signal pathway of melanin biosynthesis

4 黑色素轉運代謝機制

黑色素在黑色素小體中合成后，含黑色素的黑色素小體從黑色素細胞轉運至角質細胞中沉著.黑色素-黑色素小體轉運到角質細胞的模式主要有4種：細胞吞噬模式是角質細胞吞噬富含黑色素小體的黑色素細胞中的樹突結構；膜融合模式是黑色素細胞形成膜管狀通道與角質細胞接近并發(fā)生融合，黑色素小體由管狀通道轉移到角質細胞；脫落吞噬模式是含黑色素小體的封閉囊泡脫落后被角質細胞識別并吞噬；胞外分泌模式則是黑色素細胞以分泌的方式釋放黑色素小體到胞外，角質細胞直接吞噬黑色素小體[21,40].不同轉運機制可能基于外界不同的刺激（激素藥物、紫外線輻射）和遺傳因素等.

正常生理活動情況下，黑色素細胞通常采用細胞吞噬模式，成熟的黑色素-黑色素小體依靠細胞骨架移動和定位系統利用微管運輸，轉移到黑色素細胞周質后，從微管上釋放并轉運至鄰近的角質細胞[41].在此過程中兩類細胞表面樹突結構分子間的相互作用成為黑色素轉運的關鍵，分子間的相互作用可促使GTPase家族蛋白RAB27A以及效應因子黑色素親和素SLAC2A和肌動蛋白相關的肌球蛋白Va（114～116）形成三聚體的復合物.研究表明MITF能夠促進RAB27A的表達，從而影響黑色素在黑色素細胞的轉運[42].GTPase RAB27A、SLAC2A和Va形成的三聚體復合物還參與黑色素小體早期微管的運輸；因此黑色素正常轉運過程中，上述三聚體復合物不可替代.另外，黑色素小體轉運到黑色素細胞周質時OA1也起著至關重要的作用，OA1可調節(jié)微管依賴性黑色素小體的運動[43].當成熟的黑色素-黑色素小體通過黑色素細胞的樹狀突起被輸送至周圍的角質細胞時，每個黑色素細胞及周圍的角質細胞即構成一個結構和功能單位——表皮黑色素單位，它們共同作用完成黑色素的轉運和代謝.

黑色素分布到表皮各層細胞，是決定皮膚色澤的主要因素，大部分黑色素隨表皮角質層細胞的脫落而排出體外；也有部分黑色素受角質細胞內溶酶體作用而被降解[44]；另有部分黑色素移向真皮淺層，或被嗜黑色素細胞吞噬降解，由淋巴液輸送至淋巴結，或被運至血液循環(huán)中，經腎臟排泄至體外.以上研究結果表明，黑色素細胞形成的黑色素-黑色素小體的合成率，與其被攝取和轉運后的清除率，在正常生理活動中保持同步，處于動態(tài)平衡之中，從而維系著人類膚色的相對穩(wěn)定.

5 小結與展望

諸多因素引起的人類皮膚色素沉著過度并造成色斑，進而影響美觀，究其關鍵是黑色素合成、轉運和代謝過程紊亂，因此致力于黑色素合成、轉運和代謝相關分子機制的研究十分必要.通過對黑色素合成過程的分子調控機制的綜上研究表明：

（1）TYR、TRP-1和TRP-2的活性與黑色素合成密切相關.MITF作為黑色素合成中最重要的轉錄因子，主要參與調控TYR、TRP-1和TRP-2的轉錄，同時α-MSH/MC-1R和ASIP、MEK/ERK、PI3K/AKT、cAMP/PKA、P38、Wnt等均可影響MITF對黑色素合成進行的調控，因此干擾或阻斷MITF的表達來減少色素沉著將成為焦點.然而針對色斑，多以TYR為直接靶標的抑制劑，或基于酪氨酸酶活性位點Cu2+、酪氨酸酶底物類似物滅活劑等手段來進行治療，如熊果甘、曲酸、對苯二酚和壬二酸等[45,46]，但這類抑制劑常存在致突變、致癌或其他毒副作用的風險，在醫(yī)療使用上受到很大的限制.

（2）黑色素小體的成熟為黑色素合成和轉運提供了必要條件.PMEL的正常表達及功能發(fā)揮是成熟黑色素小體形成的關鍵，MLANA與PMEL的互作對形成的黑色素小體的穩(wěn)定性至關重要，離子泵交換蛋白SLC45A2、SLC24A5的作用是維持黑色素小體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，因此PMEL已經成為干擾黑色素小體形成的關鍵靶點.

（3）黑色素轉運過程中，由GTPase家族蛋白RAB27A、SLAC2A以及Va（114～116）構成的三聚體復合物是目前研究黑色素細胞轉運的關鍵分子，需要對該三聚體復合物的作用機制進行深入的研究.

由于對黑色素代謝機制的研究尚欠，且代謝階段對于色斑的恢復也至關重要.通過對黑色素異常合成機制的探討可知，TYR活性只是影響黑色素合成的一個環(huán)節(jié)，而在黑色素小體成熟、黑色素合成、黑色素轉運以及黑色素代謝的各個途徑中均會存在對黑色素異常沉著影響的關鍵因素.目前發(fā)現多種植物源天然產物表現出了靶向不同信號通路來抑制黑色素合成的功能，一種褐藻屬（Phaeophyceae）的紅藻醇提物乙酸乙酯相提取物，能夠通過抑制cAMP/PKA/CREB信號通路有效地抑制黑色素沉著，有望成為治療色素沉著障礙的潛在藥物[47].從決明子（Catsia tora）中分離得到的蒽酮二聚體糖苷通過抑制MITF表達進而抑制TYR、TRP-1和TRP-2來抑制B16細胞中黑色素的生成[48].這些天然產物集中在查爾酮和黃酮類、香豆素類衍生物、白藜蘆醇類似物等[49?51].此外，還有一些化合物也具有良好的應用前景，如離子通道活性劑CyPPA抑制黑色素生成是通過調節(jié)GSK 3β/β-catenin信號通路[52].新型合成酪氨酸酶抑制劑(Z)-3-(3-溴-4-羥基芐基)-噻吩-4-1（MHY1498）可在體內、體外表現出良好的褪黑作用[53].若從以上各方面著手研究降低黑色素異常沉著的靶點藥物將會大大增加治療色斑的可能性.

探尋黑色素合成、轉運、代謝的上游信號分子通路可揭示相關調控機理、全面深入了解色斑的形成機制，不僅能夠為研究新的靶標抑制劑提供有針對性的信息，也能為更好掌握各類色斑的預防和治療提供解決方案，同時也可以為尋找天然、低毒、有效抑制黑色素沉著的植物源活性物質提供新的方向.