（云南省玉溪市江川區(qū)動物疫病預防控制中心，玉溪 652600）

1 細菌學檢測方法

痰液涂片及痰結(jié)核菌培養(yǎng)試驗是結(jié)核病的主要細菌學檢測鑒定方法。除傳統(tǒng)羅氏法，目前國內(nèi)利用氧猝滅熒光原理研發(fā)的BACTEC MGIT 960熒光免疫系統(tǒng)可以快速指示培養(yǎng)管中分支桿菌耗氧量與熒光顯示的關(guān)系，經(jīng)熒光強度記憶探測器測定，數(shù)據(jù)經(jīng)處理后出結(jié)果[1]。BACTEC MGIT 960分枝桿菌系統(tǒng)較傳統(tǒng)的羅氏法對陽性標本的分離率顯著提高，可有效防止病原菌的漏檢、誤檢，其陽性報告時間提前更加明顯，但由于該系統(tǒng)試劑的價格昂貴，在臨床上推廣不現(xiàn)實。

2 免疫學檢測方法

2.1 抗原檢測

結(jié)核分枝桿菌感染機體后，機體內(nèi)便會產(chǎn)生結(jié)核抗原，如何檢測出結(jié)核抗原便能直接反映感染的存在，因此檢測結(jié)核抗原具有早期診斷價值[2]。TST是目前常用的結(jié)核病細胞免疫學檢測方法，通過注射PPD到動物機體后觀察注射部位是否產(chǎn)生變態(tài)反應作為判斷是否感染，但其結(jié)果會因個體差異而出現(xiàn)假陽性。而國外有文獻記載利用了酶鏈免疫斑點試驗(ELISPOT)可以有較高的靈敏度和特異度的間接檢測到結(jié)核菌特異性抗原，從而達到了早期快速診斷結(jié)核病的目的[3]。ELISPOT是結(jié)核病的重要輔助檢測技術(shù)，該技術(shù)可以提高診斷準確率，明確預防性治療的對象[4]。

2.2 抗體檢測

目前，各類免疫色譜卡在結(jié)核病早期快速診斷中得以廣泛應用，其中，由日本進口的Capilia TB的快速免疫色譜卡效果比較突出，它主要檢測的是在結(jié)核菌群的培養(yǎng)中分泌到菌體外的蛋白質(zhì)MPB64，且該蛋白質(zhì)只在結(jié)核分枝桿菌中產(chǎn)生，所以有很強的特異性，高親和力的抗體流經(jīng)抗原線時只與特異性抗原結(jié)合，因此Capilia TB成為快速準確診斷結(jié)核分枝桿菌的技術(shù)手段[5]。在20世紀90年代，臨床醫(yī)學主要采用DIGFA診斷結(jié)核病，檢測所使用的斑點反應板包被有固相結(jié)核分支桿菌PPD純化抗原，痰液中的抗結(jié)核分支桿菌抗體(PPD-IgG)會與這種斑點反應板上的抗原形成復合物，該復合物再與SPA或IgG結(jié)合，會產(chǎn)生紅斑點，該技術(shù)簡便、快速，適合推廣應用于衛(wèi)生、防疫等部門。蛋白質(zhì)芯片(Protein Chip,PC)[6]技術(shù)作為一種新型高通量的蛋白功能分析技術(shù)，蛋白質(zhì)芯片可以對宿主體內(nèi)多而復雜抗原譜在表達的數(shù)量或種類隨個體免疫背景和病程而表現(xiàn)出的抗體譜差異很大情況下篩選藥物作用的蛋白靶點對蛋白質(zhì)表達譜進行分析，并檢測多個結(jié)核抗體白質(zhì)，有效提升結(jié)核病診斷的陽性率，這在結(jié)核病早期快速診斷中有著重要的意義。

3 分子生物學方法

3.1 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)雖然靈敏度高、特異性強，但在臨床實際操作中經(jīng)常呈現(xiàn)假陽性、假陰性、污染等狀況，因此像逆轉(zhuǎn)錄PCR、nPCR、Real-time PCR等改進后更準確及高靈敏度的診斷技術(shù)應運而生。Real-time PCR利用TaqMan熒光探針在擴增時插入一對結(jié)核分枝桿菌復合群的特異性引物和一條結(jié)核分枝桿菌特異性熒光雙標記探針，該探針為一寡核苷酸，兩頭各標記一個報告熒光基團(Fam)和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，PCR擴增時，Taq酶的5′-3′外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，通過檢測熒光信號的強弱計算PCR產(chǎn)物[7]。由于Real-time PCR技術(shù)檢測陽性的意義僅僅提示標本含有結(jié)核分枝桿菌核酸，因此結(jié)合濃縮涂片法可以直觀的看見細菌，對Real-time PCR陽性的病例進行確認，可有效提高特異性，具備快速、精確、耗時短等優(yōu)點，可推廣用于結(jié)核病的初期診斷、快速篩查。

3.2 DNA指紋技術(shù)

DNA指紋技術(shù)是通過特異性核酸探針與結(jié)核桿菌基因組雜交后利用內(nèi)切酶酶切片段，經(jīng)電泳得到特異性的譜帶。國內(nèi)有學者采取IS6110限制性片斷長度多態(tài)性(IS6110．RFLP)、寡核苷酸分型(Spoh-gotyping)及多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列解析(MLVA)3種分型對40株結(jié)核分枝桿分別獨立解析，并對3種分型方式的結(jié)果舉行了對比，結(jié)果為：采取IS6110-RFLP手藝可以將40株菌分成35種基因型，此中33株結(jié)核分枝桿菌具備特異的基因型，占82.5%(33/40)。其余7株只有2種基因型，占17.5%(7/40)，全部都是IS61 10單菌株。這說明該方法在菌株級別對單拷貝的IS6110的菌株的鑒定效果不佳。采取Spoligotyping分型方式可以將40株菌分成17種基因型，此中11株具備特異的基因型，對7株IS6110單拷貝的菌株可以分為6個基因型。而采取MLVA分型方式可以將40株菌分成34種基因型，各型的VN-TR指紋圖譜各異，呈現(xiàn)出顯著的基因多態(tài)性。有29株結(jié)核分枝桿菌具備特異的基因型，占72.5%(29/40)。剩余11株菌表現(xiàn)出7種基因型，占27.5%(11/40)。這表明，Spoligotyping分型方式在菌株級別鑒定時的精準度低于IS6110-RFLP和MLVA。而如果將這3種方法結(jié)合起來對結(jié)核分枝桿菌進行鑒定，其效果顯著高于這3方法各自單獨利用時的效果，40株結(jié)核分枝桿菌可以分成39種基因型，只有2株菌沒有分離。因此，可將MLVA方法作為結(jié)核分枝桿菌的一線分型方法，Spoligotyping技術(shù)作為補充，而IS6110．RFLP作為二線的分型方法[8]。從而克服結(jié)核桿菌在分型、追蹤和尋覓傳染源、內(nèi)源性復發(fā)和外源性再感染或重感染中傳統(tǒng)研究的局限性，具有重要的早期快速診斷意義。

4 分子雜交技術(shù)

分子雜交是由單鏈核酸與探針按照堿基配對手段經(jīng)同位素、生物素等標識后進行鑒別。利用DNA探針雜交檢測分支桿菌，可直接在硝酸纖維膜上點樣，用結(jié)核桿菌DNA探針進行雜交，具有較高的特異性，同時用酶呈色觀察結(jié)果，使雜交信號得以放大同時提高了菌型鑒定的敏感性，縮短了檢測時間[9]。近年來雜交技術(shù)對耐藥分支桿菌進行分型的研究較為成熟，其中發(fā)夾DNA探針就是一種新型結(jié)核病初期快速診斷的方法。它利用核酸堿基配對原則和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)規(guī)律構(gòu)建的莖環(huán)布局DNA探針，對耐藥結(jié)核菌單堿基檢測具備很強的靈敏性和特異性。相關(guān)研究結(jié)果表明結(jié)核分枝桿菌對鏈霉素等氨基糖甙類藥物的耐藥性主要是由白核糖體卵白S12編碼基因rpsL和16sRNA編碼基因rrs的突變引起的，而發(fā)夾DNA探針檢測耐藥性便是操縱結(jié)核分枝桿菌耐藥性與基因突變有關(guān)機制，檢測其與耐藥性相干的突變位點，判定結(jié)核分枝桿菌的耐藥性， 該技術(shù)對單個堿基的錯配、缺失或插入突變具備較高的檢出率，不失為一種快速精準的診斷方法。

5 展望

就現(xiàn)代醫(yī)學飛速發(fā)展的今天來看，目前結(jié)核病的早期快速診斷方法很多，可以適應不同條件、不同層次的工作需要。但這些檢測和診斷方式還不敷完美。但隨著臨床醫(yī)學發(fā)展和技術(shù)改進，相信未來會必然找到快速、精準、特異的結(jié)核病初期診斷方式，使結(jié)核病可以及時診斷和治療。

[1] 易松林，譚云洪，歐陽暉．BACTEC MGIT 960分枝桿菌分析系統(tǒng)結(jié)果分析[J]．實用預防醫(yī)學，2008, 3(15):877-879．

[2] 陳俊林，顧德林，顧欣榮，等．MPB64抗原檢測快速診斷結(jié)核分枝桿菌的臨床價值[J]．臨床肺科雜志，2010,3(15):350-351．

[3] Richeldi L，Ewer K，LosiM，et al．T-cell-based diagnosis of neonatal multidrug-resistant latent tuberculosis infection[J]．Pediatrics，2007,1(119):1-5．

[4] 葉麗萍，梁艷，陳虎，等．酶聯(lián)免疫斑點試驗檢測技術(shù)在血液病合并痰涂片抗酸桿菌陰性結(jié)核病診斷中的應用[J]．中國感染與化療雜志，2010,1(10):44-48．

[5] 孫正松，王金富．免疫色譜檢測法在結(jié)核分枝桿菌檢測和鑒定的評價[J]．浙江預防醫(yī)學，2008,20(10):F0003-F0004．

[6] 孫平，張逢春，張影．蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的研究及應用現(xiàn)狀[J]．北華大學學報(自然科學版)， 2009,2(10):115-120．

[7] 彭東東，林健雄，紀麗微，等．Real-time PCR技術(shù)結(jié)合濃縮涂片染色法用于結(jié)核病快速診斷的研究[J]．中國誤診學雜志，2010,1(10):7-9．

[8] 董海燕，譚云洪，劉志廣，等．IS6110-RFLP、Spoligotyping和MLVA在結(jié)核分枝桿菌基因分型中的應用研究[J]．中華微生物學和免疫學雜志，2007,5(27):423-427．

[9] 張曉娟．DNA探針雜交技術(shù)與涂片鏡檢法檢測結(jié)核桿菌對比分析[J]．中國誤診學雜志，2008,27(8):6607-6608．