◎ 李曉丹

（德宏州質量技術監(jiān)督綜合檢測中心，云南 德宏 678400）

真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的具有毒性的次級代謝產(chǎn)物，廣泛污染農(nóng)作物、食品及飼料等產(chǎn)品。被發(fā)現(xiàn)并報道的真菌毒素主要有黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）、 赭 曲 霉 毒 素（ochratoxin，OT）、 橘 霉 素（citrinin）、展青霉素(patulin，Pat)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxvnivalenol，DON）和伏馬毒素（fumonisin）等。真菌毒素的特征主要表現(xiàn)在污染的廣泛性、危害的嚴重性上。真菌毒素直接的危害是毒素的暴露而引發(fā)急性疾病或許多慢性癥狀，如生長減慢、免疫功能下降、抗病能力差以及腫瘤的形成等。目前，真菌毒素的檢測方法主要有化學分析法、儀器分析法和免疫分析法等[1]。

1 主要真菌毒素介紹

1.1 黃曲霉毒素

黃曲霉毒素是結構相似的一大類化合物，常由黃曲霉及另外幾種霉素在霉變的谷物中產(chǎn)生，是目前為止最強的致癌物質。黃曲霉毒素以AFB1的毒性最強。黃曲霉毒素急性中毒時，可發(fā)生肝膽病變，嚴重的甚至可導致死亡；慢性中毒時表現(xiàn)為致癌性和免疫抑制等作用[2]。Soni P等[8]發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素通過遺傳和非遺傳途徑誘導多種效應，從而改變宿主細胞的功能。AFB1調節(jié)多個表觀遺傳調節(jié)器，結果顯示AFB1對多基因表觀調制的影響是已知的關鍵致癌過程。主要檢測方法有液相色譜-串聯(lián)質譜法、高效液相色譜、免疫分析法和薄層色譜法[2][6][7]。

1.2 赭曲霉毒素

赭曲霉毒素是由曲霉屬和青霉屬的某些霉菌產(chǎn)生的真菌毒素，主要有7種結構類似物，對人類的健康有影響的主要是OTA、OTB和OTC[3]。赭曲霉毒素是繼黃曲霉毒素之后又一引起世界各國廣泛關注的真菌毒素，主要出現(xiàn)在谷物、豆類、咖啡、葡萄以及飼料中，由于毒素蓄積殘留，也會出現(xiàn)在牛奶和肉類中。主要檢測方法有液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質譜法、免疫分析法和薄層色譜法[6][7]。

1.3 玉米赤霉烯酮

玉米赤霉烯酮是由鐮刀菌產(chǎn)生的一種類雌激素樣真菌毒素。主要污染玉米、大麥、高粱、大米和小米等，其中以玉米的檢出率和含量最高。ZEN具有雌激素，主要作用于生殖系統(tǒng)，可使家畜、家禽和實驗小鼠產(chǎn)生雌性激素亢進癥。妊娠期的動物食用含有ZEN的飼料可引起流產(chǎn)、死胎和畸胎。主要檢測方法有液相色譜法、熒光光度法、液相色譜-質譜法、免疫分析法[2][7]。

1.4 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇又被稱為“嘔吐毒素”，是鐮刀菌在谷物生長過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。DON在谷類作物中含量最高，啤酒、雞蛋、牛奶、肉類等農(nóng)副產(chǎn)品也有檢出。其在食品和環(huán)境中廣泛分布，通過食物鏈的傳遞對人類和動物的健康產(chǎn)生巨大威脅。主要表現(xiàn)為嘔吐、消化紊亂等。DON污染引發(fā)的食品安全隱患表現(xiàn)在其污染的廣泛性，此外還有細胞毒性、免疫毒性、遺傳毒性以及致畸性和致癌性等。主要檢測方法有高效液相色譜法、液相色譜-質譜法、薄層色譜法、免疫分析法、氣相色譜法[2][6][7]。

1.5 伏馬毒素

伏馬毒素是由鐮刀菌屬在一定溫度和濕度下產(chǎn)生的水溶性代謝產(chǎn)物。伏馬毒素在全球廣泛分布，主要分布在以玉米、高粱、小麥為主的農(nóng)作物上，造成農(nóng)業(yè)經(jīng)濟損失。到目前為止，發(fā)現(xiàn)的伏馬毒素有11種，主要以FB1、FB2、FB33種形式存在，其中以FB1危害范圍最大、毒性最強。伏馬毒素對植物代謝有毒害作用。伏馬毒素還是一種慢性促癌劑，并能引起靈長類動物的動脈粥樣硬化。主要檢測方法有高效液相色譜法、液相色譜-質譜法[2][5][7]。

1.6 麥角生物堿

麥角生物堿簡稱麥角堿，是由麥角菌屬侵害黑麥、大麥、小麥、裸麥、燕麥等禾本科植物而產(chǎn)生的生物堿毒素。麥角毒素的毒性效應主要是外周圍和中樞神經(jīng)效應，中毒癥狀表現(xiàn)為壞疽性中毒和痙攣性中毒[2]。主要檢測方法有氣相色譜-質譜聯(lián)用法、高效液相色譜法、液相色譜-質譜法[2][4]。

1.7 展青毒素

展青毒素又名棒曲霉毒素，是一類由曲霉和青霉等真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，具有影響生育、致癌、致畸和免疫等毒理作用，也是一種神經(jīng)毒素。廣泛存在于各種霉變水果和青貯飼料中。主要檢測方法有薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯(lián)用法和免疫分析法[2][3]。

1.8 其他類真菌毒素

1.8.1 橘霉素

橘霉素（Citrinin，CIT）主要由青霉屬、曲霉屬產(chǎn)生，是具有腎毒性、致畸性、致癌性和致突變性的次級代謝產(chǎn)物。主要檢測方法有薄層色譜法、免疫分析法、高效液相色譜法和高效液相色譜-質譜聯(lián)用法[7]。

1.8.2 T-2毒素和HT-2毒素

T-2毒素和HT-2毒素是由多種真菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族毒素。T-2毒素具有高毒性，人體吸入時會急性中毒。主要檢測方法有薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯(lián)用法和免疫分析法[6][7]。

1.8.3 雜色曲霉素

雜色曲霉素（sterigmatocystin）是一類結構類似的化合物，主要由雜色曲霉和構巢曲霉等真菌產(chǎn)生，雜色曲霉主要污染谷物，雜色曲霉素主要表現(xiàn)為肝、腎中毒，具有強致癌性。主要檢測方法有薄層色譜法、高效液相色譜法和高效液相色譜-質譜法、免疫分析法、化學傳感器分析等[7]。

1.8.4 白僵菌素

白僵菌素（beauvericin，BEA）是鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的六酯肽類真菌毒素，可致畸、致突變等。Mallebrera B[21]等綜述了最新的研究表明BEA是具有遺傳毒性的，產(chǎn)生DNA斷裂、染色體畸變，并通過線粒體途徑參與細胞凋亡。主要檢測方法有常規(guī)液相色譜-串聯(lián)質譜法和高效液相-串聯(lián)質譜法。

1.8.5 鏈格孢霉菌類毒素

鏈格孢霉菌是除曲霉、青霉和鐮刀菌以外的另一種重要的產(chǎn)毒菌。鏈格孢霉菌產(chǎn)生的多種次生代謝產(chǎn)物對人或牲畜具有誘變性、致癌性和致畸性。鏈格孢霉毒素中目前研究比較有代表性的毒素是AOH、AME和TeA。鏈格孢霉毒素中常用薄層色譜法、氣相色譜及氣質聯(lián)用技術、液相色譜及液質聯(lián)用技術和用于快速檢測的酶聯(lián)免疫分析[18]。Puntscher H等[25]介紹了一種含有17種毒素的LC-MS/MS方法，用于研究番茄醬、葵花籽油和小麥粉中游離和修飾鏈格孢毒素的自然發(fā)生。所建立的多重分析方法適用于不同食物基質中產(chǎn)生鏈格孢毒素。

1.8.6 恩鐮孢菌素

恩鐮孢菌素（enniatins，ENNs）和白僵菌素一樣，是由鐮刀菌屬的某些真菌產(chǎn)生的真菌毒素，目前已發(fā)現(xiàn)了20多種恩鐮孢菌素，食品中最常見的主要 是 ENA、ENA1、ENB、ENB1。Manyes L 等[22]研究Jurkat T細胞用于研究白僵菌（BEA）和enniatin B（EnNb）的毒性作用。韓小敏等[19][20]對BEA和ENNs的研究進展進行綜述并開發(fā)了同時檢測BEA和ENNs的儀器分析方法。主要檢測方法有常規(guī)液相色譜-串聯(lián)質譜法和高效液相-串聯(lián)質譜法[19]。

2 真菌毒素檢測技術研究進展

2.1 薄層色譜法

薄層色譜法（TLC）是真菌毒素的傳統(tǒng)檢測方法，樣品經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后，在紫外光照射下觀察其熒光特性，定性定量。薄層色譜法操作過程繁瑣復雜、溶劑消耗大、對實驗人員要求高、重現(xiàn)性低、靈敏度低，目前該方法已逐步被其他方法取代。

2.2 氣相色譜法及氣相色譜-質譜法

氣相色譜和氣相色譜-質譜法常用于分析熱穩(wěn)定、容易汽化、分子中不含發(fā)色基團和熒光基團，或具有弱熒光或弱吸收的真菌毒素。真菌毒素中采用氣相色譜法檢測主要是單端孢霉烯族類化合物，由于待測目標物不易揮發(fā)，樣品經(jīng)凈化處理后需進行衍生化將其轉化為低沸點的衍生物，較為耗時費力。

2.3 高效液相色譜法及高效液相色譜-質譜法

高效液相色譜和高效液相色譜-質譜法是目前食品中污染物監(jiān)測方法中適用范圍最廣泛、使用頻率最高的分析方法。具有穩(wěn)定可靠、靈敏度高的特點，適用于大多數(shù)真菌毒素，可實現(xiàn)對多種真菌毒素的定量檢測。既具備了高效液相色譜的高分辨率，又可以發(fā)揮質譜的高鑒別能力，凈化要求低、靈敏度高、可以同時進行多組分分析，能夠同時鑒別不同種屬的真菌毒素。Jiang K等[16]通過改進SPE的吸附劑，同時進行 牛 奶 中 AFB1、AFM1、OTA、ZEA、α-ZOL、β-ZOL的純化和富集，并用高效液相色譜-串聯(lián)質譜技術對牛奶中的6種目標化合物進行檢測。Carballo D等[23]用高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時分析即食食品中27種真菌毒素，包括黃曲霉毒素（B1，B2，G1，G2）、恩鐮孢菌素（A，A1，B，B1）、BEA、FB1、FB2、雜色曲霉素、DON、3-ADON、15-ADON、玉米赤霉烯醇、T-2毒素和HT-2毒素等。該方法成功地應用于25份即食食品樣品的分析。真菌毒素主要檢測在谷物、蔬菜和豆類制備的即食食品樣品中。Shao M等[24]運用利用LC-MS/MS研究狗糧中最常見的真菌毒素的發(fā)生情況。

2.4 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜

Jerome Jeyakumar JM等[11]采用高效液相色譜、液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）對鐮刀菌感染甘蔗進行了評價。建立了一種簡便、靈敏、可靠的快速檢測鐮刀菌屬8種真菌毒素的方法：FB1和FB2、DON、尼伐烯醇、3-ADON、15-ADON、ZEN和AFG1。在兩個主要產(chǎn)物離子的多反應監(jiān)測模式下進行了分析。LC/MS和MALDI-TOF MS/MS所產(chǎn)生的結果揭示了調節(jié)真菌毒素產(chǎn)生的各種機制，這有助于闡明敏感和選擇性化合物的作用。

2.5 免疫分析法

免疫分析法是利用抗原抗體反應原理對真菌毒素定性定量檢測的分析方法，具有簡單、靈敏度高、迅速等特點，可用于真菌毒素的大批量初篩。在真菌毒素檢測方法中常用的有酶聯(lián)免疫分析法以及近年來發(fā)展比較迅速的免疫膠體金技術和免疫芯片技術。酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）具有特異性強、靈敏度高、前處理簡單、易于推廣等優(yōu)點，特別適合大量樣品中真菌毒素的檢測。但ELISA具有一定的假陽性，在檢出陽性時需進一步確證。

2.6 生物芯片分析法

生物芯片是近年來在生命科學領域迅速發(fā)展起來的高新技術，具有大規(guī)模、高通量和高平行的特點，是當今世界的前沿學科和研究熱點。Man Y等[13]綜述了生物芯片在真菌檢測方面的運用。

2.7 其他新型方法

2.7.1 生物傳感器

生物傳感器是基于抗原抗體的高度親和作用，運用電化學科技將毒素的相互作用轉換成信號進行測定。Jalalian SH等[10]研制了一種檢測AFM1的新型電化學傳感器。APTASSER允許檢測AFM1，檢測限為0.9 ng/L。APTASSER傳感器成功地應用于實際樣品中AFM1的檢測，包括牛奶和血清樣品。Ma C等[12]描述了一種熒光檢測OTA，該方法對OTA具有高度選擇性。生物傳感器法目前處于實驗室研究階段。

2.7.2 核酸適配體

基于適體的結構轉換特性，Li Y[9]等報道了適配體熒光法檢測AFB1。AFB1的檢出限達到0.2 nm。該方法能夠檢測復雜樣品基質中的AFB1，例如稀釋的葡萄酒樣品和玉米粉樣品。這種基于適體的熒光法測定AFB1具有廣闊的應用前景。核酸適配體主要是基于核苷酸識別原件，同抗體比較具有差異小、純度高、性質穩(wěn)定、耐高溫等優(yōu)勢，目前并沒有商品化的核酸適配體，但是憑借其眾多明顯優(yōu)勢，有望在真菌毒素快速檢測方面發(fā)揮作用。

2.7.3 光波導模式譜

Adányi N[14]等運用光波導光模式光譜（optical waveguide lightmode spectroscopy, OWLS）應用于競爭AFB1的檢測，通過增加金的固定表面來增強信號表面。制備不同尺寸和來源的納米顆粒（通過化學或生物技術合成），觀察了AuNPS中粒徑、方法和生化參數(shù)對免疫傳感器性能的影響。在優(yōu)化敏化傳感器表面后，采用免疫傳感法對辣椒紅色素中的黃曲霉毒素進行了分析，并與HPLC測定結果進行了比較。

2.7.4 分子印跡聚合物分析

ELISA已被用于監(jiān)測FB1的食品和動物飼料污染的標準工具。ELISA并不總是有效的，因為抗體和酶組分在免疫分析中的不穩(wěn)定性、樣品中天然酶抑制劑的存在和非特異性蛋白結合的高水平。此外，由于動物在制造過程中的參與，ELISA抗體的生產(chǎn)可能耗時和昂貴。為了克服這些限制因素，已經(jīng)開發(fā)了分子印跡納米粒子為基礎的分析（Molecularly imprinted polymer nanoparticle-based assay, MINA），Munawar H等[15]設計分子印跡納米顆粒（NANOMIP）取代在競爭ELISA中使用的一級抗體。在樣品中測定是高度特異性的，并且不與其他真菌毒素（FB2、AFB1、CTT、ZEA和DON）交叉反應性。

3 結語

真菌毒素具有毒性并且廣泛分布，對人類和家畜造成危害。本文就目前主要造成危害的真菌毒素進行了簡介，并闡述了目前常用的真菌毒素檢測方法及進展。對真菌毒素的檢測主要集中于快速檢驗的篩查技術以及多種真菌毒素的同時檢測，隨著真菌毒素檢驗技術研究的進一步深入，食品安全性將得到更好的保障。