楊德慧 古梓婷 賴勝敏 羅 利 馬宇昕 劉 靖

(廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室, 廣州 510006)

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,髓鞘是由少突膠質(zhì)細(xì)胞的突起纏繞神經(jīng)元軸突所形成的管狀節(jié)段性結(jié)構(gòu),其主要成分是70%脂類(lèi)和30%蛋白質(zhì)構(gòu)成的鞘磷脂結(jié)構(gòu)[1],而有髓神經(jīng)纖維是大腦白質(zhì)的重要組成部分。目前,檢測(cè)髓鞘脂類(lèi)表達(dá)的方法有多種,其中勞克堅(jiān)牢藍(lán)(luxol fast blue, LFB)染色是一種較為常用的髓鞘染色方法[2-3]。但LFB染色也有不同的復(fù)染方法,其染色效果亦有差異。本研究通過(guò)對(duì)成年鼠和幼鼠2種不同鼠齡階段的大腦髓鞘LFB染色,比較焦油紫和伊紅2種不同復(fù)染方法的優(yōu)缺點(diǎn),為相關(guān)研究提供合適的染色方法。

1 材料和方法

1.1 試劑和動(dòng)物

LFB髓鞘染色液(G3245和G3240)購(gòu)于Solarbio公司。6周齡SPF級(jí)SD大鼠購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào)SCXK(粵)2013-0002,自由攝食和飲水。雌鼠與雄鼠合籠后單籠飼養(yǎng),在分娩后第14天(分娩當(dāng)天為0d)對(duì)母鼠和仔鼠進(jìn)行取材。本研究經(jīng)廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 動(dòng)物取材

仔鼠出生后第14天,母鼠和仔鼠在10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉下,以0.9%生理鹽水沖洗和4%多聚甲醛溶液灌注,灌注固定后取腦置于4%多聚甲醛中固定48h,組織常規(guī)脫水和石蠟包埋,用于堅(jiān)牢藍(lán)染色。

1.3 LFB染色及復(fù)染

(1) 腦組織切片脫蠟至水： 二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各15min;100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇各5min。(2) 切片轉(zhuǎn)入LFB染色液,在56℃恒溫烘箱染色24h。(3) 腦組織切片入95%乙醇洗去多余的染色后換雙蒸水洗。(4) 腦組織切片分別入Luxol分化液、70%乙醇分色30s和1min,水洗、鏡檢至最佳效果。(5) 復(fù)染： 焦油紫復(fù)染法,組織切片入新配的焦油紫染色約1min,在顯微鏡下觀察到明顯的細(xì)胞核和尼氏小體。隨著焦油紫使用次數(shù)的增加,染色時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)。伊紅復(fù)染法,組織切片入新配的伊紅復(fù)染約2min,切片被染成淡紅色,與LFB染色重疊部分顯示為藍(lán)紫色。(6) 雙蒸水洗3次后,切片用95%、100%乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)脂封固。

2 結(jié)果

2.1 母鼠胼胝體和內(nèi)囊LFB染色

胼胝體LFB染色呈藍(lán)色絲狀物,從胼胝體向皮質(zhì)下白質(zhì)延伸。內(nèi)囊LFB染色呈斑塊狀、蕁麻疹樣分布。在焦油紫復(fù)染的切片中,LFB染色呈深藍(lán)色,髓鞘脂類(lèi)較少的部位染成淺藍(lán)色,背景為白色,可見(jiàn)細(xì)胞核和尼氏小體分布(圖1，見(jiàn)封底)。伊紅復(fù)染的LFB染色中,LFB染色呈藍(lán)紫色,背景為紅色,脂類(lèi)減少的部位被伊紅填充為紅色(圖2,見(jiàn)封底)。

2.2 仔鼠胼胝體和內(nèi)囊LFB染色

幼鼠胼胝體和內(nèi)囊髓鞘均還處在發(fā)育時(shí)期,其染色尚不具有成鼠的形態(tài),焦油紫法中LFB染色呈淺藍(lán)色,細(xì)胞核和尼氏小體為藍(lán)色(圖2,見(jiàn)封底);伊紅法的LFB染色呈藍(lán)紫色,背景為紅色(圖2,見(jiàn)封底)。

3 討論

髓鞘染色在白質(zhì)性腦病的診斷和研究中具有重要作用,可用于檢測(cè)髓鞘發(fā)育的情況和脫髓鞘的程度。髓鞘染色常用的方法主要包括脂溶性染料浸染法、媒染法以及鋨酸與類(lèi)脂的特異反應(yīng)等[2-3]。LFB染色屬于脂溶性染料浸染法中的一種,盡管染色的具體步驟和時(shí)間等方法還有待于統(tǒng)一,但LFB染色的確是一種比較常用而可靠的髓鞘染色方法[4-5]。此外,也有研究使用油紅O進(jìn)行髓鞘染色,但油紅O染色需要進(jìn)行冰凍切片、配制油紅O染液中的異丙醇易揮發(fā)且對(duì)人體健康有害、切片不能長(zhǎng)期保存,而LFB染色可以避免這些缺點(diǎn)[6]。LFB屬于銅酞菁染料,在乙醇溶液內(nèi)能夠與髓鞘磷脂結(jié)合,染色后髓鞘著色鮮明,且有一定的特異性。與其他染色方法相比較,LFB染色具有操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉和著色鮮明易于觀察等優(yōu)點(diǎn)[1]。在LFB染色過(guò)程中,Luxol分色是關(guān)鍵步驟,能夠決定實(shí)驗(yàn)的成功與否。但不同的復(fù)染方法所產(chǎn)生的背景不同,顯示LFB染色的鮮明度不同,特別是在幼鼠髓鞘發(fā)育尚未發(fā)育成熟的情況下,對(duì)LFB染色的敏感度要求更高。因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)LFB染色檢測(cè)正常成年鼠和幼鼠大腦髓鞘,比較焦油紫和伊紅2種復(fù)染方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

伊紅是一種酸性化合物,容易與堿性的細(xì)胞質(zhì)結(jié)合呈現(xiàn)紅色,與LFB染色部分重疊顯示為藍(lán)紫色,藍(lán)紫色與紅色形成鮮明對(duì)比。焦油紫是一種堿性染料,能夠與細(xì)胞中酸性物質(zhì)結(jié)合,將神經(jīng)元的尼氏體、核仁染成藍(lán)色。在本實(shí)驗(yàn)中,焦油紫和伊紅兩種復(fù)染方法均能清晰地顯示母鼠胼胝體和內(nèi)囊的LFB染色,與皮質(zhì)部分界限清楚。然而在白質(zhì)中髓鞘脂類(lèi)減少的部位,焦油紫法LFB染色呈現(xiàn)淺藍(lán)色,與深藍(lán)色部分區(qū)分不夠明顯。而在伊紅法中,脂類(lèi)減少的部位被伊紅所填充,與藍(lán)紫色LFB染色形成鮮明的對(duì)比,更具直觀性。另外,幼鼠由于髓鞘尚未發(fā)育成熟,LFB染色著色少且淺,焦油紫法的LFB染色呈淺藍(lán)色,顏色較接近細(xì)胞核和尼氏小體。伊紅法的LFB染色呈藍(lán)紫色,與紅色的伊紅形成更鮮明的對(duì)比。在脫髓鞘和髓鞘發(fā)育的相關(guān)研究中,伊紅復(fù)染法更能夠敏感地反映出髓鞘LFB染色的變化,如果單純研究脫髓鞘或者髓鞘的發(fā)育,可以應(yīng)用伊紅復(fù)染法。而焦油紫復(fù)染法可以觀察到神經(jīng)元細(xì)胞核和尼氏小體的變化,適用于研究脫髓鞘與神經(jīng)元損傷、髓鞘再生與神經(jīng)元再生之類(lèi)的相關(guān)研究[7]。因此,可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌鴣?lái)選擇合適的LFB復(fù)染方法。