蘇 璐 秦鵬蕊 鄭 翔△

(四川大學(xué), 1 華西公共衛(wèi)生學(xué)院， 2 華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院, 成都 610041)

基于石蠟制片和H-E染色的常規(guī)顯微制片技術(shù)在臨床病理診斷及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的教學(xué)科研中應(yīng)用十分廣泛。高質(zhì)量的顯微切片應(yīng)能最大程度維持組織的形態(tài),做到切片完整,厚度均勻,無顯著人工假象,染色對比清晰等[1]。要想從根本上提高制片質(zhì)量,須依靠技術(shù)方法的標(biāo)準(zhǔn)化和制片條件的優(yōu)化。以小鼠腺胃常規(guī)制片為例。小鼠的腺胃與人類的胃在層次結(jié)構(gòu)和組織學(xué)特點上近似[2],常用于教學(xué)和科研觀察。但小鼠胃制片時常見腺體結(jié)構(gòu)不完整、標(biāo)本顯微結(jié)構(gòu)不清晰、收縮較嚴(yán)重以及平滑肌層過度分離等人工假像。針對這些問題,本實驗通過比較不同種類固定液的固定效果、改變pH值、滲透壓等條件,確定小鼠胃最佳固定液配方;此外,對于胃不同取材部位,處死后取材延擱時間以及胃排空前后狀態(tài)等制作條件下小鼠胃顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較;減輕了胃顯微制片中常見的人工假象,優(yōu)化了制片流程。對于其他標(biāo)本的顯微制片具有普遍的借鑒意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康雄性昆明(KM)小鼠32只,2月齡,體質(zhì)量30g±3.6g,由四川大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 實驗設(shè)計

實驗分7輪進(jìn)行,每輪針對與制片質(zhì)量密切相關(guān)的1個條件進(jìn)行比較。動物取材分組如表1。

1.3 固定液

配制標(biāo)準(zhǔn)Zamboni(多聚甲醛20g,Na2HPO4·12H2O 3.74g,NaH2PO4·2H2O 45g,飽和苦味酸150ml,pH 7.3,定容到1000ml[3])、AAF(醋酸： 85%乙醇： 40%甲醛按體積比1∶2∶17混合[4])和中性緩沖甲醛NBF(本實驗配方為多聚甲醛40g,Na2HPO4·12H2O 20g,NaOH 4g,pH 7.2,定容到1000ml[4])3種常用固定液。以NBF為基礎(chǔ),滲透壓不變,調(diào)整磷酸鹽用量,配制pH為7.2(原配方)、7.0和6.5的固定液。固定pH為7.0(根據(jù)后續(xù)結(jié)果確定),調(diào)整緩沖鹽用量,配制滲透壓1.2、1(即原液)、0.7和0.4倍的NBF固定液。

表1 小鼠腺胃顯微制片條件優(yōu)化實驗的設(shè)計

1.4 組織材料處理

小鼠禁食4h后,10%水合氯醛(0.004ml/g)腹腔注射麻醉,分別取近幽門部(距幽門3mm)橫切、胃中段(近前胃-腺胃分界處2mm)橫切、胃大彎正中縱切3種方位的標(biāo)本進(jìn)行首輪實驗。第5輪實驗中,2只小鼠禁食4h,給予食物并觀察開始進(jìn)食后20min麻醉取材。第6輪實驗中,采用3種固定方式： 整體固定后切開、切開固定(原來的方式)和局部開窗(切開前胃局部,注入固定液再浸泡)固定。第7輪實驗中,胃組織分別在小鼠死亡(呼吸心跳停止,不從尸體分離)后0、0.5、1、2h(室溫約25℃)開始固定,固定條件均為4℃,16h。按四氫呋喃法[5]常規(guī)石蠟包埋,6μm切片,H-E染色。

1.5 顯微觀察和分析

染色切片通過Olympus BX41顯微鏡觀察,經(jīng)定制轉(zhuǎn)接筒連接Olympus C5060wz相機(jī)拍攝。顯微形態(tài)比較時,各組2個標(biāo)本的觀察結(jié)果一致為有效。切片核質(zhì)區(qū)分度的分析通過Image Pro Plus 5.5進(jìn)行： 每組2個標(biāo)本,各取3個視野,分別自動選取胞核、胞質(zhì)區(qū)域,測定透光強(qiáng)度(intensity)的值進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 腺胃前部橫切獲得的結(jié)構(gòu)相對更完整和典型

腺胃3種斷面的形態(tài)比較如圖1A～C。其中,腺胃前部(距分界線2mm)橫切面上,胃壁層次清晰完整,胃底腺結(jié)構(gòu)相對典型,腺管呈縱切面,腺內(nèi)主細(xì)胞、壁細(xì)胞排列清晰可辨(圖1A)。在近幽門部的橫切面,胃壁層次也清晰可辨,但有較多胃底腺被斜切;該斷面上腺管細(xì)而短,結(jié)構(gòu)差異大且不典型,主細(xì)胞與壁細(xì)胞排列不規(guī)律(圖1B)。胃大彎正中縱切面不能穩(wěn)定呈現(xiàn)清晰的胃壁層次,黏膜皺襞大多呈現(xiàn)斜行或橫斷面,腺體長度因黏膜褶皺而變化較大,不利于觀察腺體的完整結(jié)構(gòu)(圖1C)。

2.2 NBF和Zamboni固定液效果相當(dāng),制片結(jié)果均優(yōu)于AAF

取3種標(biāo)準(zhǔn)配方固定液處理的腺胃前部橫切片比較。其中,NBF(圖2A)和Zamboni(圖2B)固定液處理后,標(biāo)本染色結(jié)果清晰,結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)保存良好。Zamboni液處理的標(biāo)本壁細(xì)胞著色更強(qiáng)(伊紅染色更紅),但主細(xì)胞嗜堿性區(qū)域的區(qū)分度欠佳。NBF液不造成收縮。AAF固定液也不造成收縮,但伊紅染色強(qiáng)度顯著下降,胞質(zhì)呈均質(zhì)狀,細(xì)節(jié)不清,各腺細(xì)胞間分界也不清楚(圖2C)。

2.3 固定液pH和切片H-E染色的紅藍(lán)對比負(fù)相關(guān)

pH 6.5、7.0和7.2的標(biāo)準(zhǔn)NBF固定液處理的標(biāo)本,其切片的H-E染色結(jié)構(gòu)均顯示清晰。顯微圖像分析顯示,隨pH升高,核質(zhì)著色的光強(qiáng)度對比值有下降趨勢(圖3)。由于酸性甲醛不利于長時間處理和儲備,且染色區(qū)分度并無優(yōu)勢,故綜合考慮,小鼠腺胃以pH 7.0的配方為佳。

圖3 固定液不同pH對H-E染色核質(zhì)區(qū)分度的影響

2.4 NBF滲透壓在標(biāo)準(zhǔn)配方0.7倍時顯微結(jié)構(gòu)的保存質(zhì)量最佳

取pH 7.0、相對標(biāo)準(zhǔn)配方的滲透壓為1.2、1、0.7倍和0.4倍的改變型NBF,比較固定效果。其中,0.7倍滲透壓的NBF造成的收縮、變形或結(jié)構(gòu)松散最小(圖4B);1.2倍滲透壓會造成顯著的細(xì)胞收縮(圖4A);而0.4倍則同樣造成一定的收縮,且細(xì)胞質(zhì)和胞外基質(zhì)均松散,伊紅著色能力下降(圖4C)。故對于小鼠腺胃,滲透壓0.7倍于標(biāo)準(zhǔn)配方的條件最理想。

2.5 禁食小鼠的胃黏膜維持自然形態(tài)

攝入食物后,小鼠胃底腺主細(xì)胞的嗜酸性區(qū)域著色顯著減弱,呈空虛狀態(tài),細(xì)胞略有變形(圖5A)。禁食后胃底腺各細(xì)胞保持飽滿和良好的著色(圖5B)。取材前禁食有利于提高圖像質(zhì)量。

2.6 開窗固定條件下胃壁結(jié)構(gòu)變形最小

胃整體固定后切開,黏膜結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)特別是主細(xì)胞顯示不清,結(jié)構(gòu)收縮,表面黏液細(xì)胞著色較差(6A)。切開后固定,黏膜被收縮的平滑肌牽拉,胃壁彎曲方向改變甚至反轉(zhuǎn),黏膜表面結(jié)構(gòu)離散變形(6B)。開窗固定不存在這些人工假象(圖6C),為最佳固定方式。

2.7 小鼠死亡后2h內(nèi),延遲取材對光鏡結(jié)構(gòu)的影響有限,但著色減弱

觀察小鼠死亡后0、0.5、1h和2h的胃切片,光鏡下各時間點并無顯著的結(jié)構(gòu)區(qū)別。隨取材時間延遲,切片上細(xì)胞各成分H-E染色的著色強(qiáng)度較立即固定的標(biāo)本減弱(蘇木素和伊紅著色均受影響，圖7A、B)。

3 討論

本實驗對小鼠腺胃常規(guī)顯微制片條件進(jìn)行了優(yōu)化探索。經(jīng)過針對性的實驗比較,總結(jié)出較好的制片技術(shù)條件： 小鼠禁食4h后,麻醉并手術(shù)分離整個胃;從前胃局部開窗,注入滲透壓650mOsm/L(相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)配方0.7倍)、pH 7.0的NBF,并用該液繼續(xù)在4℃浸泡固定16h;固定后切取距前胃-腺胃分界線2mm的腺胃組織行常規(guī)石蠟切片、H-E染色。按該流程操作,鏡下形態(tài)自然、結(jié)構(gòu)成像清晰,人工假象相對最少。

圖1 小鼠腺胃不同切片部位和方向的形態(tài)比較,標(biāo)尺=100μm。A： 距腺胃-前胃分界約2mm處橫切面;B： 距幽門約2mm處橫切面;C： 胃大彎正中橫切面.圖2 小鼠腺胃經(jīng)3種常用甲醛固定液處理后的H-E染色結(jié)果比較,標(biāo)尺=50μm。A： 中性緩沖甲醛(NBF)固定;B： Zamboni液固定;C： 醋酸-乙醇-甲醛液(AAF)固定;↑： 示胃底腺主細(xì)胞.圖4 固定液不同的滲透壓(緩沖鹽濃度)對小鼠腺胃結(jié)構(gòu)的影響,標(biāo)尺=50μm。A： 1.2倍;B： 0.7倍;C： 0.4倍;△： 示收縮產(chǎn)生的空隙;↑： 示細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)松散.圖5 小鼠攝食與禁食后腺胃結(jié)構(gòu)比較,標(biāo)尺=50μm。A： 攝食后取材;B： 禁食4h取材;“↑”示胃底腺主細(xì)胞.圖6 不同取材固定方式對腺胃形態(tài)的影響,A： 標(biāo)尺=50μm;B,C： 標(biāo)尺=100μm。A： 整體固定后再切開;B： 切開固定;C： 經(jīng)前胃開窗固定;△： 示收縮產(chǎn)生的空隙;*： 示著色不良的表面黏液細(xì)胞;↑： 示胃底腺主細(xì)胞.圖7 立即取材和延遲取材的染色結(jié)果比較,2組切片系同時染色,標(biāo)尺=50μm。A： 處死后立即取材;B： 處死2h取材.

在比較技術(shù)條件時,固定液配方的種類是首先比較的項目。不同的標(biāo)本應(yīng)采用最適的配方進(jìn)行處理。通常,成年哺乳動物標(biāo)本可在中性緩沖甲醛(NBF)、緩沖甲醛—苦味酸(Zamboni)[3]和乙酸—乙醇—甲醛(AAF)[4]中比較擇優(yōu)。本實驗中,NBF和Zamboni對小鼠腺胃的固定效果遠(yuǎn)優(yōu)于AAF,總體上都達(dá)到優(yōu)良質(zhì)量。但胃底腺主細(xì)胞的嗜堿性區(qū)經(jīng)Zamboni液處理后,與嗜酸性區(qū)的區(qū)分不如NBF清晰(處理胰外分泌部標(biāo)本時也存在該問題),故NBF應(yīng)作為首選。

選定最佳固定液種類后,pH值的實驗比較應(yīng)先于滲透壓實驗。因為不同滲透壓的固定液在pH改變時,紅藍(lán)對比的變化幅度不同(本文未顯示該數(shù)據(jù))。先在標(biāo)準(zhǔn)滲透壓下確定理想的pH,再比較不同的滲透壓,結(jié)果更可靠。本實驗未設(shè)pH超過7.2的條件,因為此時固定作用緩慢,日常實驗不常用。本實驗得出小鼠腺胃標(biāo)本的理想滲透壓為標(biāo)準(zhǔn)配方的70%。NBF標(biāo)準(zhǔn)配方的滲透壓約為940mOsm/L[4],故本實驗的最佳滲透壓數(shù)值約為650mOsm/L。高滲和低滲條件都會造成標(biāo)本收縮。其中,高滲固定液使標(biāo)本在固定環(huán)節(jié)發(fā)生收縮,細(xì)胞間隙拉大;而低滲造成的收縮產(chǎn)生在固定后、浸蠟前的脫水環(huán)節(jié),以細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)松散、胞外基質(zhì)紊亂為主要表現(xiàn)。

大動物的胃可采用切開注入固定液再縫合的方法固定[6]。小鼠胃太小,為保全腺胃結(jié)構(gòu),從前胃開窗注入固定液,既不會因平滑肌受刺激收縮造成人工假象,也可輕松完成操作。動物死亡后多久取材固定才不影響顯微結(jié)構(gòu)的觀察,是形態(tài)學(xué)實驗中最常提出的問題之一。由于胃分泌消化酶和酸,一般認(rèn)為應(yīng)優(yōu)先盡快固定,否則易發(fā)生溶解和損傷。本實驗中,胃不從尸體分離的情況下延遲至2h固定,光鏡觀察仍不能區(qū)分出顯著的結(jié)構(gòu)變化,同時染色的情況下僅有組織著色偏淺這一變化(加長染色時間可克服)。因此,在顯微水平的實驗中,胃的取材、固定并不急迫,不需提高取材次序的優(yōu)先級別。

本實驗雖以小鼠腺胃顯微制片為例,但技術(shù)優(yōu)化所采用的實驗流程可以應(yīng)用到其他標(biāo)本的制片工作中。先比較取材部位(如分葉、分區(qū)、切片的橫縱方向等),然后選擇最佳固定液,再優(yōu)化固定條件(pH、滲透壓等),最后優(yōu)化取材條件(如充盈、空虛,如為免疫器官還要考慮率免疫狀態(tài))和確定允許的延遲取材時間。這一實驗方法對提高制片質(zhì)量有普遍意義。針對其他組織,如果篩選出的最佳固定液是AAF(如睪丸),則應(yīng)分別對甲醛、醋酸和乙醇的不同體積配比進(jìn)行實驗比較;如果為含苦味酸的固定液,則應(yīng)比較甲醛和苦味酸以不同配比組合后的固定效果。除非組織質(zhì)地特殊,NBF一般不需調(diào)整甲醛含量(恒定4%),否則會影響后續(xù)免疫組織化學(xué)等分子原位檢測操作中已經(jīng)成熟的技術(shù)條件。

綜上,組織標(biāo)本的常規(guī)顯微制片雖然屬于歷史悠久的傳統(tǒng)技術(shù),但要穩(wěn)定地制作出高質(zhì)量的切片,還是離不開科學(xué)的實驗和探索。本實驗雖僅涉及小鼠腺胃制片,但其他標(biāo)本的制片都應(yīng)進(jìn)行類似的試驗比較,方可確知最佳的制片條件。希望本實驗對常規(guī)顯微制片工作有拋磚引玉的作用。