程 玉 劉 曼 王明娟 薛 晶

(承德醫(yī)學(xué)院, 1 病理學(xué)教研室, 2 附屬醫(yī)院病理科, 承德 067000)

據(jù)估計(jì),全球每年新增胃癌病例95.16萬(wàn),死亡病例72.31萬(wàn),包括中國(guó)在內(nèi)的東亞地區(qū)是該疾病的高發(fā)區(qū)域[1]。在我國(guó),其發(fā)病率男性中排名第二,女性中排名第三[2]。目前對(duì)于胃癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)還很局限,認(rèn)為是多個(gè)信號(hào)通路參與的復(fù)雜過(guò)程。近年來(lái)研究表明,Hedgehog過(guò)表達(dá)與胃癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,但其具體作用機(jī)制目前還無(wú)定論?？p隙連接蛋白43(Cx43)是縫隙連接蛋白家族中的重要成員,其能維持正常細(xì)胞間信息交換、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化[3]。目前有研究表明,Hedgehog可通過(guò)調(diào)節(jié)在乳腺癌細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)從而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[4],然而Hedgehog通路能否通過(guò)調(diào)控Cx43從而調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的增殖及凋亡查閱文獻(xiàn),尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究應(yīng)用Hedgehog通路抑制劑cyclopamine阻斷該通路,觀察胃癌細(xì)胞MGC-803細(xì)胞增殖和凋亡能力變化,以及其對(duì)縫隙連接蛋白Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)的影響,初步探討此通路在胃癌細(xì)胞增殖及凋亡中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞及試劑

人胃癌MGC-803細(xì)胞由承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所饋贈(zèng);cyclopamine、MTT及DMSO均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基及胰酶購(gòu)自Gibco公司;胎牛血清購(gòu)自四季青;TUNEL試劑盒購(gòu)自羅氏公司;qRT-PCR試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;Cx43多克隆抗體購(gòu)自Bioworld;所用引物由TaKaRa設(shè)計(jì)合成,引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將MGC-803細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%時(shí),胰蛋白酶消化,1∶3傳代。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

收集對(duì)數(shù)期MGC-803細(xì)胞,細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104/ml 分于96孔板中,置于37℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)。24h后,吸掉各孔內(nèi)的培養(yǎng)基,加入濃度分別為5、10、20、30、40、50μmol/L的cyclopamine,同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照0μmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h后,加入20μl MTT溶液,繼續(xù)孵育4h。終止培養(yǎng),小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加入DMSO 100μl,置于水平搖床上震蕩10min。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)定吸光度。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔、對(duì)中孔,每孔設(shè)3復(fù)孔。

1.4 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC-803細(xì)胞,胰蛋白酶消化至懸液,將細(xì)胞接種于6孔板,每孔2ml,置于溫箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h,吸棄原培養(yǎng)基,加入不同濃度的cyclopamine(0、30、40μmol/L),處理48h后,棄上清。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟,經(jīng)過(guò)水合、細(xì)胞通透、加TUNEL反應(yīng)液等步驟,最后放于暗濕盒中反應(yīng)37℃,1h,加1滴PBS再計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)Cx43 mRNA的表達(dá)

加入不同濃度cyclopamine(0、30、40μmol/L)之后,放于溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h后,用TRIzol提取細(xì)胞總RNA,用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)成cDNA,用SYBR Premix Ex Taq II反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件： 95℃預(yù)變性30s,95℃ 變性40s,60℃退火30s,共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,2-△△ct方法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 免疫印跡檢測(cè)Cx43蛋白表達(dá)

收集MGC-803細(xì)胞,用RIPA裂解液提取總蛋白,BCA法檢測(cè)蛋白濃度。收集的蛋白樣品中加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液,沸水浴加熱3～5min,充分變性蛋白。直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi),每孔20μg,常規(guī)電泳及轉(zhuǎn)膜,硝酸纖維膜于5%脫脂奶粉中室溫封閉1h,加入Cx43(1∶500)及β-actin一抗,4℃孵育過(guò)夜。經(jīng)TBST洗膜后,加入對(duì)應(yīng)的二抗,室溫孵育1h。再經(jīng)TBST洗膜,ECL化學(xué)發(fā)光曝光顯影。用Image J圖像軟件分析目的條帶,計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MGC-803細(xì)胞增殖抑制率

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,經(jīng)30、40μmol/L cyclopamine處理48h后,MGC-803細(xì)胞增殖抑制率明顯升高(P<0.05,P<0.01)(圖1)。

圖1 各組MGC-803細(xì)胞增殖抑制率

2.2 MGC-803細(xì)胞凋亡率

TUNEL結(jié)果顯示,MGC-803細(xì)胞經(jīng)30、40μmol/L cyclopamine處理48h后,與空白對(duì)照組相比,處理組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)(圖2)。

2.3 Cx43 mRNA表達(dá)

30、40μmol/L cyclopamine作用細(xì)胞48h后,與空白對(duì)照組相比,Cx43 mRNA表達(dá)水平明顯增高(P<0.05,P<0.01)(圖3)。

圖2 各組MGC-803細(xì)胞凋亡率

圖3 Cyclopamine處理后Cx43 mRNA表達(dá)變化

2.4 Cx43蛋白表達(dá)

30、40μmol/L cyclopamine作用細(xì)胞48h后,與空白對(duì)照組相比,Cx43蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.05,P<0.01)(圖4)。

圖4 Cyclopamine處理后Cx43 蛋白表達(dá)變化

3 討論

在我國(guó)胃癌的發(fā)病率和死亡率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于歐美發(fā)達(dá)國(guó)家,對(duì)國(guó)民健康造成了極大的危害,胃癌的高度侵襲性和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌患者高死亡率的主要原因。胃癌細(xì)胞的無(wú)限增殖和癌細(xì)胞凋亡失控是其侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ),但是目前胃癌細(xì)胞異常增殖和凋亡的分子機(jī)制并不清楚。

近期有研究指出,從慢性炎癥到胃癌的一步步演變過(guò)程中,Hedgehog信號(hào)通路起著至關(guān)重要的作用[5]。該信號(hào)通路異常激活與人類多種惡性腫瘤的發(fā)病相關(guān),比如肺癌,肝細(xì)胞癌,大腸癌等[6-8]。人類Hedgehog信號(hào)通路主要由分泌型信號(hào)蛋白Shh配體、跨膜蛋白受體Ptch和另一跨膜蛋白Smo以及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白組成,可簡(jiǎn)述為Hh-Ptch-Smo-Gli信號(hào)軸[9]。

在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用非常廣泛的Hedgehog信號(hào)通路cyclopamine可以特異性結(jié)合和抑制Smo[10]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用cyclopamine阻斷Hedgehog信號(hào)通路,觀察胃癌MGC-803細(xì)胞增殖和凋亡。結(jié)果顯示,阻斷Hedgehog通路后胃癌MGC-803細(xì)胞增殖活力下降,而細(xì)胞凋亡率增高。該結(jié)果提示,Hedgehog信號(hào)通路可能是胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡的分子機(jī)制。

為了進(jìn)一步探討Hedgehog信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞增殖及凋亡的機(jī)制,阻斷Hedgehog信號(hào)通路后,本研究應(yīng)用qRT-PCR和免疫印跡分別檢測(cè)了Cx43 mRNA和蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示Cx43 mRNA和蛋白的表達(dá)都增多。此研究結(jié)果提示,Hedgehog通路可能同時(shí)調(diào)節(jié)了Cx43的mRNA和蛋白水平的表達(dá)。本課題組前期研究顯示,Cx43 mRNA及蛋白在胃癌組織中表達(dá)明顯少于正常胃黏膜中的表達(dá),其參與了胃癌的發(fā)生及發(fā)展,并且與PI3K/Akt等信號(hào)通路相關(guān)[11]。所以筆者推測(cè),Hedgehog通路作用于胃癌的機(jī)制可能與Cx43 mRNA及蛋白相關(guān)。Hedgehog通路與Cx43 mRNA及蛋白之間存在一定的關(guān)聯(lián),但是主要集中于胚胎細(xì)胞方面。有研究者證實(shí)[12],在心肌胚胎干細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中具有協(xié)同作用。還有研究表明[13],在胚胎期小鼠的舌中,抑制Cx43基因會(huì)阻斷Hedgehog通路。還有一項(xiàng)研究指出[14],Cx43基因突變或者敲除都能導(dǎo)致并指的發(fā)生,其機(jī)制是由于Cx43基因突變或者敲除抑制了Hedgehog。新近研究報(bào)道,Hedgehog通路可通過(guò)影響Cx43蛋白膜表達(dá),從而調(diào)控乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖和凋亡[4]，但是關(guān)于胃癌細(xì)胞中兩者相互作用關(guān)系,目前尚未完全清楚。

綜上所述,本研究證實(shí)了Hedgehog信號(hào)通路可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,并且表明該通路影響胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制可能與調(diào)控Cx43 mRNA及蛋白有關(guān)。但此研究還存在一些不足,如只是通過(guò)阻斷Hedgehog信號(hào)通路觀察Cx43 mRNA和蛋白表達(dá)變化,后續(xù)還需要通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)激活該信號(hào)通路再研究Cx43 mRNA和蛋白的表達(dá)。此外,Hedgehog信號(hào)通路是如何影響Cx43 mRNA和蛋白表達(dá)的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究闡明。