王滿才 王向文 馬玉婧 張 昕 魏振剛 張亞武 馬建忠 徐小東 張有成

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院普外科, 蘭州 730000)

在神經(jīng)系統(tǒng)研究領(lǐng)域,為了實現(xiàn)從完整的生物組織中獲得其詳細(xì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)及分子信息,科學(xué)家們做出了長久不懈的嘗試和努力,也因此帶動了相關(guān)領(lǐng)域研究技術(shù)的革新[1-2]。傳統(tǒng)方法中,為了達(dá)到以上目的,科研中采用最多最成熟的方法是組織切片和結(jié)構(gòu)重建技術(shù)[3]。然而,該技術(shù)最大的缺點是大多數(shù)研究只能在極小范圍的神經(jīng)組織中進(jìn)行,而切片會導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)一定程度上的變形或破壞,同時所獲得的組織信息僅為20～50μm 的厚度[3],即使是使用當(dāng)前最先進(jìn)的雙光子顯微鏡,其可視厚度也不超過600～800μm[4],這極大地限制了對腦內(nèi)一些物質(zhì)分布不同腦區(qū)基因表達(dá)情況的研究,也完全不能滿足從組織的整體水平研究其結(jié)構(gòu)-功能相關(guān)性的需求,故在很大程度上限制了相關(guān)領(lǐng)域研究的進(jìn)展。

現(xiàn)有技術(shù)的不足以及未來研究對新技術(shù)的需求,共同促使相關(guān)技術(shù)研究的發(fā)展和創(chuàng)新,出現(xiàn)了諸如SCALE[5]、CUBIC[6]、SeeDB[7]、PARA[2]及CLARITY[8-10]等一系列創(chuàng)新性技術(shù)的問世,其中CLARITY技術(shù)最具有全面優(yōu)勢和應(yīng)用前景。

1 CLARITY技術(shù)的誕生

2013年5月,美國斯坦福大學(xué)的Chung等在《Nature》雜志上首次報道了一種名為“CLARITY”的全新腦組織形態(tài)和生物分子分析技術(shù)[8]。該技術(shù)不僅能使大腦變得透明可視,更重要的是,它能保證大腦中最重要的構(gòu)成物質(zhì)保持在原位,能在完整的腦組織原位呈現(xiàn)立體的神經(jīng)突觸與神經(jīng)纖維投射網(wǎng)絡(luò)、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),以及蛋白質(zhì)、核酸和神經(jīng)遞質(zhì)等生物分子的分布部位和精細(xì)空間結(jié)構(gòu)[9]。該技術(shù)被稱為是2013年全球最重要的科技進(jìn)展[11],這一創(chuàng)舉必將在很大程度上加速奧巴馬總統(tǒng)提出的腦科學(xué)研究計劃。

自該技術(shù)誕生以來,已有大量的研究對其進(jìn)行了論證、應(yīng)用及改良[4,12-13],在我國各大媒體及學(xué)者中也引起了廣泛的關(guān)注。由于CLARITY技術(shù)起初主要是用于腦組織科學(xué)的研究,故此有研究者將其稱之為“透明腦”技術(shù)。然而,隨后的研究證明,該技術(shù)用于其他如腎、肝、胰、肺及腸等組織的研究完全可行[13],故此筆者認(rèn)為將其翻譯為“透明組織”技術(shù)更為合理。

2 CLARITY技術(shù)的基本原理[8-10]

細(xì)胞膜的主要框架結(jié)構(gòu)為磷脂雙分子層,也正是這些脂類的屏障作用影響了細(xì)胞乃至組織的通透性和透光性。CLARITY技術(shù)通過加熱一種小分子凝膠樣物質(zhì)將組織中的重要生物分子如蛋白質(zhì)、核酸和神經(jīng)遞質(zhì)等牢牢地固定在原位,而將未固定的脂類通過電泳從組織中去除,從而實現(xiàn)最大可能的物質(zhì)通透性及透光性。

2.1 水凝膠-組織混合物制備

首先,用事先準(zhǔn)備好的水凝膠單體溶液(主要成分為丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、多聚甲醛及VA-044引發(fā)劑)對麻醉后的實驗動物經(jīng)心充分灌注,再將分離后的組織標(biāo)本浸入4℃的水凝膠單體溶液中一定時間,最后將組織加熱至37℃至凝膠單體完全聚合。在該過程中,丙烯酰胺納米單體會逐漸滲透進(jìn)入組織和細(xì)胞內(nèi)。同時,多聚甲醛不僅能與含NH3+的生物分子(蛋白質(zhì)、核酸及其他小分子等)發(fā)生交聯(lián),也能與凝膠單體進(jìn)行共價結(jié)合,從而使得凝膠單體與生物分子之間形成了間接結(jié)合。在37℃條件下,凝膠單體會發(fā)生聚合反應(yīng),連同生物分子共同形成了一種穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚合性凝膠混合物。值得注意的是,在整個過程中,組織中的脂質(zhì)成分均未參與以上聚合反應(yīng),因此為后續(xù)脂質(zhì)的電泳提供了條件。

2.2 組織電泳[8,10]

在硼酸和十二烷基磺酸鈉(SDS)緩沖液中,給上述水凝膠-組織混合物提供適宜的直流電壓和溫度,表面原本帶有負(fù)電荷的SDS微團(tuán)會隨電場發(fā)生移動,將分布于組織及細(xì)胞中的脂質(zhì)分子攜帶清除,而其他重要的功能性生物分子,如蛋白質(zhì)等,則因網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的保護(hù)而固定在原來位置,其結(jié)構(gòu)和數(shù)量基本保持完整不變。最后經(jīng)過折射率(IR～1.45)與水凝膠相近的均質(zhì)液(甘油或FocusClear等)處理后,從而制備出一種均質(zhì)透明的組織模型。

CLARITY技術(shù)使組織透明后,除一些特殊的實驗動物(如轉(zhuǎn)基因熒光小鼠)其自身帶有熒光信號外,可以對感興趣的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸等進(jìn)行后續(xù)的標(biāo)記,研究者便可以在光學(xué)顯微鏡下直觀地觀察、研究組織中各個感興趣區(qū)域相關(guān)分子的分布、表達(dá)、網(wǎng)絡(luò)連接及投射關(guān)系等。

3 CLARITY技術(shù)的設(shè)備構(gòu)成[3,8,10]

3.1 通風(fēng)廚

實驗中所使用的丙烯酰胺、雙丙烯酰胺及多聚甲醛等均具有毒性,可對人體造成較大的損害,故所有相關(guān)的操作都應(yīng)在通風(fēng)廚中進(jìn)行。同時在操作期間必須戴口罩、手套及穿防護(hù)衣,確保實驗者安全。

3.2 氮氣罐和干燥箱

氮氣罐主要是提供氮氣,用于置換組織標(biāo)本及水凝膠液體中的氧氣,有利于水凝膠液體發(fā)生充分的聚合;干燥箱主要用于提供密閉空間,配合氮源一起使用,可用密封較好的小動物麻醉箱等充當(dāng)。

3.3 真空泵

用于充分抽盡干燥性的空氣和氮氣,提供絕對真空環(huán)境。

3.4 電泳裝置

3.4.1 電泳槽 用于安裝鉑電極和電泳組織標(biāo)本,可用耐臟的聚丙烯廣口瓶充當(dāng)。目前文獻(xiàn)報道的主要有60ml(VWR,No.36319-547;Thermo Scientific, No. 2118-0002)[3,10]和125ml(Thermo Scientific, No.2118-0004)[10]2種規(guī)格。

3.4.2 鉑電極 鉑絲具有耐高溫、高電壓等特性,是充當(dāng)電極的較好材料。但直徑不能太細(xì),容易被燒壞,推薦直徑為0.5mm(Alfa Aesar, No.10286; Sigma-Aldrich,no.267201-2G)[3,10]。

3.4.3 標(biāo)本架 用于電泳過程中組織標(biāo)本的固定,可用細(xì)胞過濾網(wǎng)充當(dāng)。

3.4.4 耐高溫網(wǎng) 配合樣品架用于組織標(biāo)本的固定,同時防止標(biāo)本與電極接觸,避免燙傷損壞。

3.4.5 分流器和過濾器 分別接于電泳槽兩端,分流電泳緩沖液。目前文獻(xiàn)中報道的主要有4通[10]分流和6通[3]分流。過濾器主要用于緩沖液的過濾,一端連接過濾器,另一端連接低溫液體循環(huán)器。

3.4.6 低溫液體循環(huán)器 用于控制電泳過程中緩沖液的流速和溫度。

3.4.7 電壓可控電源及適配器 用于提供電壓,最好能同時提供多通道穩(wěn)定電壓(如Bio-Rad, PowerPac TM, No.164-5070)。

3.4.8 耐高溫防水膠 主要用于各部件之間的黏合固定。

3.5 其他

試管、注射器、動物手術(shù)器械、不同規(guī)格塑料管及香蕉插頭等。

4 CLARITY技術(shù)的優(yōu)勢

與傳統(tǒng)的組織切片及重建技術(shù)相比,CLARITY技術(shù)用于組織結(jié)構(gòu)及功能的研究具有明顯的優(yōu)勢,具體表現(xiàn)如下：

4.1 克服了脂質(zhì)對光線折射的影響,明顯增加了光線穿透的深度[3,4,8,10,12]

傳統(tǒng)的切片技術(shù)對標(biāo)本的厚度具有苛刻的要求(20～50μm)[3],其主要是受普通顯微鏡可穿透深度的限制,即使是應(yīng)用當(dāng)前較為先進(jìn)的雙光子顯微鏡,其可視深度也在600～800μm[4]之間,仍很難滿足當(dāng)前研究的需求。而造成這種限制的根本原因除了顯微鏡方面的缺陷外,更主要是因為組織及細(xì)胞中的脂質(zhì)分子對光線的折射作用所致。CLARITY技術(shù)通過電泳完美去除了脂質(zhì)分子,降低甚至避免了其對光線的干擾,明顯加深了光線的穿透深度。同時顯微技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,將使得觀察更深的組織空間結(jié)構(gòu)成為現(xiàn)實。

4.2 降低了對組織結(jié)構(gòu)和重要組成成分的破壞[3,10]

CLARITY技術(shù)通過多聚甲醛與丙烯酰胺/雙丙烯酰胺以及組織內(nèi)重要的生物分子之間形成了穩(wěn)定的網(wǎng)狀水凝膠結(jié)構(gòu),將這些重要的生物分子穩(wěn)定地固定在原有位置,再通過電泳去除未被固定的脂質(zhì)分子,從而最大程度上降低了似傳統(tǒng)切片技術(shù)對組織的結(jié)構(gòu)及重要組成成分的破壞,使其更接近于真實情況。

4.3 增加了組織的通透性,有利于大分子物質(zhì)的通過[3,10]

CLARITY技術(shù)在增加組織透明度及重要分子穩(wěn)定性的同時,在水凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上還形成了許多均勻的孔隙,這些孔隙為一些大分子物質(zhì)(如抗體等)的出入提供了通道,從而為實現(xiàn)組織內(nèi)重要物質(zhì)的染色標(biāo)記成為了可能。

4.4 保證了組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,可經(jīng)受多次漂洗和染色標(biāo)記[10]

水凝膠組織穩(wěn)定的結(jié)構(gòu),為其經(jīng)受多次染色漂洗提供了保障。研究顯示,多次的漂洗再染色不會明顯導(dǎo)致重要生物分子的丟失,這將明顯提高了同一批組織標(biāo)本的有效利用,使得不同指標(biāo)之間具有更強(qiáng)的可比性。

4.5 應(yīng)用范圍廣[3,13]

自該技術(shù)成功應(yīng)用于腦組織內(nèi)突觸及軸突等結(jié)構(gòu)的研究以來,后續(xù)的證據(jù)表明,其幾乎可適用于任何軟組織的研究,如肝、脾、腎、肺、睪丸及腸組織等。因此,該技術(shù)不僅將在神經(jīng)系統(tǒng),更將在其他系統(tǒng)具有廣闊的應(yīng)用前景,如在全腦上進(jìn)行長距離投射或局部環(huán)路研究;研究細(xì)胞之間的相互關(guān)系,亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白復(fù)合體,核酸和神經(jīng)遞質(zhì)等;在全腦上進(jìn)行原位分子雜交,還可以進(jìn)行反復(fù)的免疫組化染色和洗脫后的復(fù)染等等。

5 CLARITY技術(shù)的不足

盡管該技術(shù)在組織的結(jié)構(gòu)-功能研究方面具有明顯的優(yōu)勢和誘人的前景,但目前仍存在著一些不足。(1) 顯微鏡方面： 盡管目前已有CLARITY專用目鏡的使用,但其進(jìn)行圖像采集的速度仍然較慢,不利于大數(shù)據(jù)的獲取;(2) 軟件方面： 當(dāng)前仍舊缺乏成熟的局部圖像分析、3D重建、自動跟蹤技術(shù)及大數(shù)據(jù)儲存和處理方法,限制了實驗結(jié)構(gòu)的定量分析;(3) 組織膨脹問題： 電泳過程中的組織膨脹可能會導(dǎo)致精細(xì)結(jié)構(gòu)的破壞,盡管采用“4+1”的溫控模式可能降低膨脹程度,但其可靠性有待繼續(xù)論證;(4) 實驗要求較高： 該技術(shù)對實驗條件的要求較高,尤其是對用于圖像采集所需顯微鏡的要求更高,因而限制了其在普通實驗室的廣泛推廣和應(yīng)用。以上存在的不足將為該技術(shù)的進(jìn)一步完善提出了更大的挑戰(zhàn)。