楊旭

（湖北省恩施州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，恩施 445000）

0 引言

病理技術(shù)是病例診斷的前提，同時(shí)也是病理研究領(lǐng)域的重要方法學(xué)，因此在生物醫(yī)療活動(dòng)中發(fā)揮十分關(guān)鍵的作用。然而由于當(dāng)前各種針吸檢查與內(nèi)窺鏡檢查的普遍應(yīng)用，使這些檢查送檢的標(biāo)本數(shù)量不斷增加，這些標(biāo)本均呈現(xiàn)米粒狀、針尖狀等。對(duì)微小組織進(jìn)行制片的過(guò)程十分復(fù)雜，極易導(dǎo)致組織缺失或摻雜別的組織，使標(biāo)本被污染，因此需要在病理技術(shù)方面進(jìn)行改進(jìn)。

1 微小標(biāo)本預(yù)處理方法

對(duì)微小活檢組織的預(yù)處理十分重要。合理的預(yù)處理能縮短制片時(shí)間，最大限度還原組織形態(tài)和病理特征，做出準(zhǔn)確診斷。鄭玉琴[1]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)微小組織標(biāo)本的固定效果，對(duì)病例診斷的準(zhǔn)確程度產(chǎn)生較大的影響。很多內(nèi)窺鏡均是通過(guò)多點(diǎn)取材的方式，組織標(biāo)本延擱予濾紙上面，無(wú)法有效固定，易導(dǎo)致一些微小組織標(biāo)本由于標(biāo)底濾紙吸水，組織標(biāo)本牢固地吸附于濾紙上面不能分離，即使強(qiáng)行將其取下，也會(huì)粘帶肉眼不可見(jiàn)的濾紙纖維，極大地影響微小組織的固定，使切片很容易碎裂，降低診斷的準(zhǔn)確性。借助光面白紙可以處理標(biāo)底紙對(duì)組織標(biāo)本吸水過(guò)多、防止微小組織不易同襯底分離、粘帶紙纖維等情況。避免制片中的組織出現(xiàn)碎裂的情況，提高制片質(zhì)量。微小組織能與普通外科手術(shù)標(biāo)本共同浸蠟、脫水，不用專(zhuān)門(mén)解決，使操作流程更加簡(jiǎn)便。掌握微小組織的固定、脫水等預(yù)處理流程，便可得到完整、清楚的微小組織切片，有效地提升診斷與組織標(biāo)本分類(lèi)、分型的準(zhǔn)確程度。

2 微小組織快速冰凍切片法

由于科學(xué)技術(shù)的快速進(jìn)步，冰凍切片不斷成為病理科眾多工作中重要內(nèi)容之一，為進(jìn)行準(zhǔn)確的術(shù)中診斷提供基礎(chǔ)。由于醫(yī)療技術(shù)水平的日益提升以及醫(yī)學(xué)技術(shù)的逐漸發(fā)展，使人們?cè)絹?lái)越關(guān)注健康的重要性。臨床醫(yī)生與病人要求對(duì)直徑3 mm以下的微小組織進(jìn)行迅速正確的診斷，由于這些組織的體積過(guò)小，對(duì)其進(jìn)行制片與診斷并不容易，阻礙該項(xiàng)工作的實(shí)施。為更好地處理該問(wèn)題，研究人員做了大量探索、改進(jìn)，取得一些進(jìn)展。微小組織在冰凍切片中的包埋是一大難題，用半導(dǎo)體切片機(jī)通過(guò)瓊脂包埋，使微小組織或破碎組織不僅能進(jìn)行冰凍切片，而且切片形態(tài)保持完整，效果較好。梁忠泉[2]等使用甲基纖維素替代OCT包埋劑，并將原組織包埋托進(jìn)行完善，令切片刀同組織包埋托的接觸面積不斷減少，有利于對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行觀察，不會(huì)破壞刀口，修切時(shí)應(yīng)避免把組織樣本切完。在被打濕的小濾紙片上滴少量液體膠，再把微小組織平放于滴有少量液體膠的小濾紙上方，最后放于冷臺(tái)上冷凍3～5 min再實(shí)施切片。

3 微小組織石蠟包埋切片法

石蠟塊可以長(zhǎng)時(shí)間保存，良好的微小組織切片既能給臨床科室與病人提供充足的時(shí)間，還能有效地提升臨床診斷與組織樣本分類(lèi)分型的準(zhǔn)確程度。微小組織由于組織體積小，通過(guò)脫水等相關(guān)處理后，會(huì)逐漸縮小，因此容易丟失。脫水后組織顏色為灰白色，不易被發(fā)現(xiàn)，特別是包埋后與蠟的顏色相近，導(dǎo)致切片時(shí)不容易發(fā)現(xiàn)組織。將組織放入微孔包埋盒中，立即投入含有2%伊紅、0.9%氯化鈉溶液中，浸泡30 min左右，使組織著色。用擦鏡紙將固定好的微小組織包裹，放入包埋盒中進(jìn)行脫水。微小組織由于體積較小，脫水時(shí)間與常規(guī)脫水時(shí)間不同。采用超聲微波法，分別將100%乙醇、丙酮以及二甲苯放在預(yù)熱鋁板上進(jìn)行脫水、透明，以縮短脫水透明時(shí)間。將95%乙醇、無(wú)水乙醇、二甲苯放入80 ℃烘箱中以縮短脫水透明時(shí)間。蠟塊包埋時(shí)，較小組織不易將其包埋在中間，采用預(yù)包埋法，將微小組織先用熔化的蠟液包埋，利用后加注的蠟液溫度將預(yù)包埋的蠟逐漸熔化，冷卻成型后，使組織與蠟完全融為一體，使其固定于包埋模中央，便于切片。對(duì)細(xì)針穿刺微小組織進(jìn)行滴膠石蠟雙重包埋的方法，該方法對(duì)細(xì)胞學(xué)診斷具有較高的實(shí)用價(jià)值。將合成膠水作為預(yù)包埋材料，主要是考慮到針吸組織的體積小，不利于尋找，直接石蠟包埋十分復(fù)雜，只有進(jìn)行預(yù)包埋后，使組織微粒裹成型，體積變大，有利于脫水、透明操作。合成膠水為高分子化合物，主要是借助淀粉通過(guò)酸化或熱處理后生成的糊精樣產(chǎn)物，極易溶解在熱水中，但不能溶解在乙醇中，按照該特性把通過(guò)膠水包埋的組織投放入乙醇中，在脫水時(shí)膠滴不斷凝聚成型，有助于進(jìn)行石蠟雙重包埋，操作便捷。微小組織必須借助伊紅指示著色，進(jìn)而在包埋后有助于判斷其同附近蠟面的界限與預(yù)測(cè)切片的深度，而且，切片刀較為鋒利，在操作時(shí)應(yīng)該小心、謹(jǐn)慎，借助微調(diào)手輪對(duì)露出的切面進(jìn)行修整。滴膠預(yù)包埋借助凹孔有機(jī)玻璃板把微小微粒組織集中到同一個(gè)平面上，使其不易分散、漂浮，避免切片不完整導(dǎo)致漏診情況的發(fā)生。通常針吸微小組織滴膠包埋后應(yīng)該借助單獨(dú)脫水的方式，由于膠滴在凝固后密度增加，同時(shí)組織包裹中的水很難滲透出來(lái)，因此浸蠟、脫水以及透明需要合理增加時(shí)間，確保制片的效果[3]。

4 微小組織HE染色和免疫組化研究

由于微小組織體積小，因此對(duì)染料滲透性較好。改進(jìn)傳統(tǒng)的HE染色步驟，先將微小活檢組織進(jìn)行HE染色，之后進(jìn)行系列脫水、包埋、切片。用紙片將每個(gè)送檢微小組織連同病理編號(hào)一起包好，滴加伊紅染液，用鋼圈固定后進(jìn)行微小組織的固定、脫水、透明、浸蠟，制作的蠟塊能連續(xù)切片，蠟帶舒展、良好，展片無(wú)皺褶，HE染色后各種細(xì)胞成分著色鮮艷，能滿足診斷的要求。微量組織的HE染色時(shí)需用熱水反藍(lán)，既能預(yù)防細(xì)胞核退行性染色過(guò)度，又能將組織邊緣多余的包埋試劑（如膠質(zhì)）殘留污漬清洗溶解，使切片明亮潔凈。

微量組織進(jìn)行組織化學(xué)染色雖然無(wú)特殊之處，但是對(duì)于微量組織組化操作依然需要謹(jǐn)慎對(duì)待。如組織過(guò)小，操作中易脫落，因此需控制好操作時(shí)間和力度。在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)操作中對(duì)微量組織的組化操作進(jìn)行一系列優(yōu)化：第一，切片烘烤要充分，否則組織微粒甚小、附著力較差容易造成脫片；第二，在梯度酒精水化步驟適當(dāng)縮短時(shí)間；第三，縮短抗原修復(fù)時(shí)間；第四，孵育微量抗體時(shí)加蓋蓋玻片，防止少量抗體揮發(fā)，使有限的抗體覆蓋均勻。同時(shí)，應(yīng)該也探索微量組織的高通量和組織芯片組操作技術(shù)，將數(shù)十至上百個(gè)甚至更多小的組織整齊有序地排列在一張載玻片上制成縮微組織芯片，即組織切片。這樣既充分利用切片的空間，又節(jié)省操作時(shí)間，還可以對(duì)大量組織進(jìn)行同一化操作，使試驗(yàn)結(jié)果更具有可比性，增強(qiáng)免疫組化結(jié)果的可信度和正確性。

5 結(jié)束語(yǔ)

微小組織病理切片制作是對(duì)病理技術(shù)的一大考驗(yàn)。使用有顏色的染料將組織染色，在組織包埋中易于識(shí)別，極大地提高包埋速度和質(zhì)量。而且染色組織在白色蠟塊中非常醒目，容易掌握蠟塊的切修深度，確保切片的質(zhì)量，便于病理診斷。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的不斷提高，所取組織的體積將會(huì)越來(lái)越小，因此需要不斷地提高病理技術(shù)，為病理診斷提供優(yōu)質(zhì)的切片。充分了解微小組織的固定、脫水浸蠟、包埋、冷凍、切片和染色等幾個(gè)方面的程序，便可以制出組織完整、清楚以及色澤鮮艷的微小組織切片，以期有效提升診斷與組織分類(lèi)分型的準(zhǔn)確程度。