張艷艷，彭 輝，肖天放

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福州 350002)

滋養(yǎng)外胚層的形成對(duì)早期胚胎的發(fā)育至關(guān)重要。滋養(yǎng)外胚層完整性受損將導(dǎo)致囊胚形成失敗甚至死亡，同時(shí)滋養(yǎng)外胚層的滲透性和液體轉(zhuǎn)運(yùn)功能受阻也將導(dǎo)致囊胚形成失敗；滋養(yǎng)外胚層不能正確地分化將造成胚胎不能附植或附植后形成的胎盤(pán)畸形，進(jìn)而增加胎兒的流產(chǎn)率和死亡率，因此，研究調(diào)控滋養(yǎng)外胚層完整性和功能的分子機(jī)制具有重要的理論和實(shí)踐意義。

1 哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育

哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育到一定時(shí)期發(fā)生胚胎致密化，致密化是以相鄰卵裂球界限不清、細(xì)胞變扁和E-cadherin依賴細(xì)胞間黏附的確立為特征的形態(tài)變化過(guò)程。卵裂球獲得以微絨毛頂端定位為特征的細(xì)胞極性和獲得胞質(zhì)極性，之后隨著細(xì)胞分裂，外部細(xì)胞保持極性并產(chǎn)生滋養(yǎng)外胚層上皮。在囊胚形成的過(guò)程中，滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞形成有黏附連接和緊密連接功能的轉(zhuǎn)運(yùn)上皮[1]。鈉泵(Na+/K+-ATPase)的活性導(dǎo)致穿過(guò)滋養(yǎng)外胚層離子梯度的確立和囊胚腔形成過(guò)程中的液體積聚[2]。此外，水通道有助于穿過(guò)滋養(yǎng)外胚層的水運(yùn)動(dòng)并導(dǎo)致囊胚腔擴(kuò)張[3]。囊胚從透明帶中孵出以后，滋養(yǎng)外胚層又分化為2種滋養(yǎng)層細(xì)胞：覆蓋內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞，稱極滋養(yǎng)層(polar trophoblast)；圍繞囊胚腔的細(xì)胞，稱壁滋養(yǎng)層(mural trophoblast)。極滋養(yǎng)層增殖活躍，刺激極滋養(yǎng)層增殖的信號(hào)起源于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，并且在局部起作用[4]。壁滋養(yǎng)層細(xì)胞圍繞囊胚腔，不能與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)緊密連接。附植以后，覆蓋在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)外面的極滋養(yǎng)層細(xì)胞繼續(xù)增殖，形成包含滋養(yǎng)層干細(xì)胞的胚外外胚層(extra-embryonic ectoderm, ExE)和二倍體的絨毛膜錐(ectoplacental cone, EPC)，同時(shí)壁滋養(yǎng)層細(xì)胞停止分裂形成滋養(yǎng)層巨細(xì)胞[5]。

2 哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)外胚層發(fā)育需要的關(guān)鍵基因及其相互關(guān)系

2.1 哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)外胚層發(fā)育需要的關(guān)鍵基因

在附植前胚胎發(fā)育過(guò)程中，調(diào)節(jié)滋養(yǎng)外胚層發(fā)育的基因主要有含TEA結(jié)構(gòu)域的家族成員4 (TEA domain family member 4,Tead4)、尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2 (caudal type homeobox 2,Cdx2)和Eomes(eomesodermin)，且這3個(gè)基因都是滋養(yǎng)外胚層發(fā)育所必需的[6-8]。Cdx2在滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)譜系分化中起作用，Eomes參與極滋養(yǎng)層和壁滋養(yǎng)層細(xì)胞命運(yùn)的控制，Ets家族成員E74樣轉(zhuǎn)錄因子5 (E74-like factor 5,Elf5)在極滋養(yǎng)層細(xì)胞譜系分化過(guò)程中，參與控制胚外外胚層和絨毛膜錐的細(xì)胞決定[9]。此外，SRY盒轉(zhuǎn)錄因子2 (SRY-box 2,Sox2)和叉頭框轉(zhuǎn)錄因子D3 (forkhead box D3,Foxd3)對(duì)滋養(yǎng)層和外胚層的發(fā)育也非常重要[10]，母源性的Sox 2調(diào)控滋養(yǎng)層的分化命運(yùn)[11]，而敲除Foxd3將影響早期胚胎外胚層的形成[12]。

在小鼠未受精卵母細(xì)胞和受精合子中幾乎檢測(cè)不到Tead4 mRNA，但從2-細(xì)胞期開(kāi)始，Tead4表達(dá)增加一直貫穿整個(gè)胚泡期，在8-細(xì)胞和桑椹胚期Tead4的表達(dá)達(dá)到峰值[6]，此時(shí)，正是滋養(yǎng)外胚層形成和分化的關(guān)鍵時(shí)期。Tead4在滋養(yǎng)層干細(xì)胞中表達(dá)極顯著高于在胚胎干細(xì)胞中表達(dá)，而在滋養(yǎng)層干細(xì)胞分化成滋養(yǎng)層巨細(xì)胞的過(guò)程中，這種高水平表達(dá)一直維持著。然而，Tead4在胚胎干細(xì)胞分化成胚狀體的過(guò)程中一直低水平表達(dá)，說(shuō)明Tead4主要在滋養(yǎng)外胚層中起作用[6]。敲除Tead4基因后，Tead4-/-胚胎桑椹胚以前的發(fā)育與Tead4+/+和Tead4+/-胚胎沒(méi)有差異，之后，Tead4-/-胚胎不能形成囊胚腔，維持著桑椹胚樣的形態(tài)[13]。細(xì)胞數(shù)量與Tead4+/+和Tead4+/-胚胎的細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有顯著差異[13]，說(shuō)明盡管Tead4-/-胚胎的細(xì)胞增殖沒(méi)有阻斷或延遲，但卻不能形成滋養(yǎng)外胚層。在Tead4-/-胚胎中所有測(cè)定的滋養(yǎng)外胚層特異基因Cdx2、整聯(lián)蛋白α 7 (integrin alpha 7，Itga7)和鈣黏蛋白3 (cadherin 3，Cdh3)均沒(méi)有表達(dá)，而Eomes和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2 (fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)gfr2)的表達(dá)顯著降低，表明，滋養(yǎng)外胚層發(fā)育失敗[13]，從而說(shuō)明了滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育離不開(kāi)Tead4的表達(dá)[14]。

Cdx2在滋養(yǎng)外胚層中的表達(dá)是所知道的譜系分化的早期事件之一[15]，免疫熒光定位分析表明，Cdx2從8-細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)，從8-～32-細(xì)胞，Cdx2的表達(dá)水平明顯增加[16]。在囊胚階段早期，Cdx2的表達(dá)更多的限制在胚胎外部細(xì)胞；在擴(kuò)張囊胚階段，Cdx 2蛋白只定位在滋養(yǎng)外胚層的細(xì)胞核。敲除Cdx2基因后，Cdx2-/-胚胎能夠形成囊胚腔，但囊胚腔卻不能維持，并伴隨著滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的改變，而Cdx2+/+和Cdx2+/-胚胎能夠形成擴(kuò)張囊胚，并從透明帶中孵出[7]，說(shuō)明敲除Cdx2基因后滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育不完全或發(fā)育失敗。分析滋養(yǎng)層特異的標(biāo)志基因表明，Cdx2-/-胚胎能夠表達(dá)滋養(yǎng)外胚層標(biāo)志基因Eomes和Fgfr2，但Eomes的表達(dá)顯著降低，分化的滋養(yǎng)層巨細(xì)胞標(biāo)志基因Hand1和Pl1的表達(dá)在Cdx2-/-胚胎中檢測(cè)不到，而它們?cè)贑dx2+/+和Cdx2+/-胚胎中能夠檢測(cè)到[7]。進(jìn)一步的研究表明，Cdx2-/-胚胎在體外不能形成滋養(yǎng)層巨細(xì)胞或滋養(yǎng)層干細(xì)胞，說(shuō)明胚胎早期滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育需要Cdx2表達(dá)。

Eomes轉(zhuǎn)錄物首次在囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞中被檢測(cè)到，之后在胚外外胚層持續(xù)表達(dá)[8]。小鼠早期胚胎缺乏Eomes，將導(dǎo)致胚胎阻滯在囊胚期，究其原因發(fā)現(xiàn)，突變的滋養(yǎng)外胚層不能分化為滋養(yǎng)層，也不能進(jìn)一步分化為極滋養(yǎng)層和壁滋養(yǎng)層細(xì)胞[8]。因此，滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育需要Eomes參與。

2.2 哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)外胚層特異性基因Tead 4、Cdx 2和Eomes之間的關(guān)系

在鼠胚早期發(fā)育過(guò)程中，Tead4首先在2-細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)，在8-細(xì)胞和桑椹胚Tead4的表達(dá)達(dá)到峰值。在Tead4-/-胚胎中Cdx2的表達(dá)劇烈下調(diào)，表明Tead4在Cdx2上游調(diào)節(jié)滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育[13]。因?yàn)樵?-～18-細(xì)胞Cdx2微弱表達(dá)，同時(shí)Cdx2表達(dá)的維持或上調(diào)需要Tead4。然而，在Tead4-/-胚胎中，Eomes不表達(dá)或微弱表達(dá)[6,13]，出現(xiàn)這種情況的原因可能為檢測(cè)的方法不同而導(dǎo)致檢測(cè)的靈敏度不同，總之，Eomes高水平表達(dá)需要Tead4 的存在，說(shuō)明Tead4在Eomes的上游起調(diào)節(jié)作用。Cdx2從8-細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)，從8-～32-細(xì)胞，Cdx2的表達(dá)水平明顯增加。在Cdx2-/-胚胎中Eomes表達(dá)顯著降低和在胚胎干細(xì)胞中通過(guò)Cdx2能夠快速誘導(dǎo)Eomes表達(dá)，說(shuō)明Eomes在Cdx2下游區(qū)，但在Cdx2-/-胚胎中，Eomes持續(xù)表達(dá)也表明，存在Eomes表達(dá)不依賴Cdx2機(jī)制[7]。在Tead4-/-胚胎中Eomes不表達(dá)，暗示Tead4調(diào)節(jié)Eomes不依賴Cdx2。Tead4-/-胚胎不能形成囊胚，Cdx2-/-胚胎能夠形成暫時(shí)的囊胚，之后囊胚腔很快塌陷，而Eomes-/-胚胎能夠形成擴(kuò)張囊胚，表明在Eomes-/-胚胎中，Tead4和Cdx2能夠正常表達(dá)。

Tead4、Cdx2和Eomes可能通過(guò)3種不同的途徑調(diào)節(jié)滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育和囊胚腔形成。第1種是Cdx2依賴途徑，Tead4在外部細(xì)胞中激活Cdx2，Cdx2促進(jìn)滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育。第2種是Eomes依賴途徑，Tead4激活Eomes的表達(dá)，Eomes再調(diào)節(jié)滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育。同時(shí)，Cdx2也能激活Eomes。第3種是Tead4依賴途徑，Tead 4不依賴Cdx2和Eomes而直接調(diào)節(jié)滋養(yǎng)外胚層特異基因的表達(dá)。總之，Tead4、Cdx2和Eomes相互協(xié)作促進(jìn)滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育。

3 調(diào)控哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)外胚層完整性和功能相關(guān)的蛋白

滋養(yǎng)外胚層的完整性和功能維持對(duì)附植前胚胎發(fā)育至關(guān)重要。滋養(yǎng)外胚層的完整性和功能受到損壞將導(dǎo)致胚胎發(fā)育停止、不能形成囊胚腔或胚胎致死。影響滋養(yǎng)外胚層完整性和功能蛋白主要有粘附連接蛋白、緊密連接蛋白、Na+/K+-ATPase和水通道蛋白等。

在胚胎致密化過(guò)程中，粘附連接蛋白E-cadherin與catenin形成粘附復(fù)合體，一方面，有利于外部卵裂球的極化，另一方面，有利于緊密連接的形成和滋養(yǎng)外胚層的分化。Catenin包括α-catenin、β-catenin和γ-catenin。研究表明，β-catenin敲除胚胎和γ-catenin敲除胚胎能夠發(fā)育到囊胚階段[17-18]，說(shuō)明滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育正常，其完整性和功能能夠繼續(xù)維持。然而，E-cad-/-胚胎不能形成滋養(yǎng)外胚層上皮和囊胚腔[19]，而α-catenin敲除胚胎的滋養(yǎng)外胚層上皮也是異常的[20]，表明在滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育中E-cadherin和α-catenin起著非常重要的作用。

在囊胚的形成過(guò)程中，滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞間由緊密連接形成所產(chǎn)生的滲透性封閉十分重要，是囊胚形成的必要條件。如果緊密連接封閉不充分，轉(zhuǎn)運(yùn)的物質(zhì)很可能通過(guò)細(xì)胞間的縫隙而滲漏，致使不能形成擴(kuò)張囊胚。研究表明，在胚胎的早期發(fā)育過(guò)程中完全敲除或沉默ZO-2[21]、ZO-3[22]、Cingulin[23]和Occludin[24]并不影響緊密連接的形成，而使ZO-1 沉默將導(dǎo)致胚胎不能發(fā)育到囊胚[25]。敲除組織中特異表達(dá)的Claudin基因顯示緊密連接的形成和屏障功能被破壞[26-28]，說(shuō)明緊密連接的形成需要ZO-1和Claudin蛋白的表達(dá)與正確組裝。

在囊胚形成之前，Na+/K+-ATPase極化分布在滋養(yǎng)外胚層基底外側(cè)膜[29]。在桑椹胚～囊胚的形成過(guò)程中，Na+/K+-ATPase亞基基因表達(dá)上調(diào)，且Na+/K+-ATPase的活性顯著增加，用Na+/K+-ATPase的特異性抑制劑Ouabain處理之后影響囊胚形成[30]，說(shuō)明Na+/K+-ATPase在囊胚的形成過(guò)程中發(fā)揮作用。此外，Na+/K+-ATPase β亞基本身具有細(xì)胞間黏附分子的功能[31]，在早期胚胎的發(fā)育過(guò)程中，緊密連接的組裝需要Na+/K+-ATPase的活性[32]，因此，Na+/K+-ATPase還能夠調(diào)節(jié)滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞間緊密連接的形成和功能[30]。

在囊胚形成過(guò)程中，水通道蛋白(AQPs)在促進(jìn)水運(yùn)動(dòng)方面可能起著重要的作用[33]。目前，在哺乳動(dòng)物上已經(jīng)鑒別出11個(gè)水通道蛋白，根據(jù)該家族蛋白對(duì)水和小分子的選擇性通透作用，該家族蛋白又可分為2個(gè)亞群。AQP 0、AQP 1、AQP 2、AQP 4、AQP 5、AQP 6、AQP 8和AQP 10對(duì)水分子具有高度選擇性，而AQP 3、AQP 7和AQP 9的選擇性相對(duì)較差，允許小分子通過(guò)[34]。

Na+/K+-ATPase和AQPs介導(dǎo)的穿過(guò)滋養(yǎng)外胚層的水運(yùn)動(dòng)，加上緊密連接封閉以阻斷水的滲漏是促進(jìn)囊胚形成的主要機(jī)制。由此可知，在胚胎的早期發(fā)育過(guò)程中，粘附連接蛋白、緊密連接蛋白、Na+/K+-ATPase和水通道蛋白對(duì)滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育和囊胚形成起著至關(guān)重要的作用。

4 維持滋養(yǎng)外胚層完整性和功能的蛋白與Tead 4和Cdx 2之間的關(guān)系

由上述可知，在胚胎的早期發(fā)育過(guò)程中，粘附連接蛋白(E-cadherin和α-catenin)、緊密連接蛋白(ZO-1)、Na+/K+-ATPase和AQPs在滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育和囊胚形成方面起重要作用。E-cad-/-胚胎和α-cat-/-胚胎發(fā)育異常，ZO-1和Na+/K+-ATPase β1亞型沉默都將導(dǎo)致胚胎不能發(fā)育到囊胚，而Tead4-/-胚胎和Cdx2-/-胚胎的滋養(yǎng)外胚層譜系發(fā)育失敗，胚胎不能形成囊胚腔或形成的囊胚腔不能維持，因此推測(cè)，粘附連接蛋白(E-cadherin和α-catenin)、緊密連接蛋白(ZO-1)、Na+/K+-ATPase和AQPs與Tead4及Cdx2之間可能存在某種關(guān)系。E-cadherin、α-catenin、ZO-1 α-、Na+/K+-ATPase和關(guān)鍵的AQPs在胚胎附植前發(fā)育的所有階段都表達(dá)，Tead4和Cdx2可能直接或間接調(diào)控E-cadherin、α-catenin和ZO-1 α在粘附連接復(fù)合體和緊密連接上的組裝、Na+/K+-ATPase在滋養(yǎng)外胚層膜區(qū)的定位或插入到膜區(qū)以及關(guān)鍵AQPs的表達(dá)與功能。ZO-1 α和Na+/K+-ATPase β1亞型在桑椹胚～囊胚的轉(zhuǎn)換過(guò)程中表達(dá)，推測(cè)Tead4和Cdx2很可能直接或間接調(diào)控ZO-1和Na+/K+-ATPase β1基因表達(dá)。

5 展 望

利用基因敲除方法分別制作Tead4-/-和Cdx2-/-胚胎，對(duì)滋養(yǎng)外胚層特異基因的表達(dá)以及滋養(yǎng)外胚層的分化機(jī)理進(jìn)行研究。Tead4-/-和Cdx2-/-胚胎不能形成囊胚腔或形成的囊胚腔不能維持，暗示滋養(yǎng)外胚層的完整性和功能受到損壞。對(duì)粘附連接成分E-cadherin和β-catenin以及緊密連接成分ZO-1的定位進(jìn)行研究，同時(shí)研究細(xì)胞極化成分、JNK底物蛋白c-Jun以及p38 MAPK信號(hào)，結(jié)果只有E-cadherin和ZO-1的定位有些異常，其它的均正常[13,15]，說(shuō)明Tead4或Cdx2與滋養(yǎng)外胚層連接的形成有一定關(guān)系，但二者之間有什么因果關(guān)系仍不清楚。Tead4或Cdx2應(yīng)該還存在調(diào)控滋養(yǎng)外胚層完整性和功能的其它機(jī)制[35-36]。Na+/K+-ATPase和AQPs在囊胚的形成過(guò)程中起著重要作用，Tead4-/-和Cdx2-/-胚胎的囊胚腔形成失敗可能與Na+/K+-ATPase和AQPs相關(guān)的機(jī)制沒(méi)有進(jìn)行深入研究。通過(guò)RNA干擾與基因敲除技術(shù)建立Tead4或Cdx2沉默與敲除的胚胎，Tead4和Cdx2的表達(dá)與粘附連接蛋白(E-cadherin和α-catenin)、緊密連接蛋白(ZO-1α-和ZO-1 α+)、Na+/K+-ATPase和關(guān)鍵AQPs的表達(dá)與定位之間的關(guān)系，闡明Tead4和Cdx2維持滋養(yǎng)外胚層完整性和功能的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究和證實(shí)。