張 壽，靳國恩，常 蘭*，呂 軍，沈明華，劉 惠，顧海燕，雷乃虎

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016； 2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心，西寧 810001； 3. 青海省天峻縣畜牧獸醫(yī)工作站，天峻 817200)

增加肺的通氣量是平原動(dòng)物(包括人)進(jìn)入高原后迅速適應(yīng)高原低氧環(huán)境的反應(yīng)之一。資料報(bào)道急性高山病(acute mountain sickness，AMS)[1-2]的發(fā)病率與人的相對(duì)低通氣量有關(guān)，增加通氣量是防制AMS發(fā)生的主要措施之一。許多學(xué)者對(duì)人和動(dòng)物有關(guān)低氧通氣反應(yīng)及其發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了大量研究，如Chiodi[3]報(bào)道美洲高原印第安人存在低氧通氣反應(yīng)(hypoxic ventilatory response，HVR)減弱和肺通氣功能降低的趨勢；Hodges等[4]對(duì)3個(gè)近交系大鼠品種和1個(gè)遠(yuǎn)交大鼠品種進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HVR受基因多樣性的影響，不同品種的大鼠在低氧時(shí)呼吸表型(如頻率、節(jié)奏)也不一樣。Strohl等[5]報(bào)道HVR還受大鼠品種、個(gè)體、性別的影響，且品種是主要的影響因素。研究發(fā)現(xiàn)大鼠的每分通氣量、頻率、潮氣量均與品種有關(guān)(如每分通氣量SD大鼠大于K大鼠、Z大鼠，頻率BN大鼠大于K大鼠，潮氣量SD大鼠大于BN大鼠、K大鼠、Z大鼠)。Ye等[6]研究發(fā)現(xiàn)大鼠頸動(dòng)脈體(carotid body，CB)中低氧所誘導(dǎo)的一氧化氮(nitric oxide，NO)增加可以促進(jìn)其對(duì)慢性低氧的適應(yīng)性，而且結(jié)構(gòu)性一氧化氮合酶(constitutive nitric oxide synthase，cNOS)和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)參與了NO生成，在慢性低氧時(shí)NO生成增多又可鈍化CB對(duì)低氧化學(xué)感受的敏感性等。有關(guān)高原牦牛頸動(dòng)脈體形態(tài)學(xué)方面的研究我們已有報(bào)道[7-8]，但對(duì)牦牛HVR及其機(jī)制方面鮮有研究。為此，我們對(duì)生活在青藏高原(海拔3 200 m) 低氧環(huán)境中牦牛的HVR及NO、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)含量與柴達(dá)木黃牛進(jìn)行比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料

選取青海省海西蒙古族藏族自治州(海拔3 200 m)臨床健康的成年雌性牦牛和柴達(dá)木黃牛各10頭進(jìn)行低氧(13.9% O2)通氣反應(yīng)，經(jīng)頸動(dòng)脈放血處死后立即分離出CB投入液氮中，待用于ELISA雙抗體夾心法檢測。在屠宰季節(jié)另選取海拔3 200 m成年健康牦牛和柴達(dá)木黃牛各10頭處死，迅速取出CB，其中左側(cè)CB置入4%多聚甲醛磷酸緩沖液(0.01 mol·L-1，pH 7.4) 中固定，用于免疫組織化學(xué)染色；右側(cè)CB投入液氮中，分別用于ELISA雙抗體夾心法檢測和熒光定量PCR。

1.2 方法

1.2.1 低氧通氣反應(yīng) 牛保定后牛耳剪毛便于檢測血氧飽和度(SaO2)。戴上呼吸面罩(面罩呼氣口連接多功能生理信號(hào)采集系統(tǒng))后，在常氧下呼吸5～10 min，用MP150型多導(dǎo)電生理記錄儀(16通道)(美國Biopac公司)描記連續(xù)呼吸曲線，并用YX301型脈搏血氧儀測定血氧飽和度(SaO2)；吸入低氧(13.9% O2)混合氣體(模擬海拔6 000 m)12 min，重復(fù)記錄上述內(nèi)容；根據(jù)MP150型多導(dǎo)電生理記錄儀記錄的呼吸曲線采集潮氣量(TV)、呼吸頻率(Bf)，計(jì)算每分通氣量(VE)=TV×Bf(60 s)，用吸入低氧后SaO2下降和VE增加的絕對(duì)值的比值(ΔVE/ΔSaO2)來計(jì)算低氧通氣反應(yīng)的斜率。

1.2.2nNOS、eNOS和iNOS基因表達(dá)鑒定

1.2.2.1 總RNA提取和cDNA合成：用TRIZOL法提取海拔3 200 m牦牛和柴達(dá)木黃牛CB總RNA，選取OD260 nm/OD280 nm值介于1. 8 ～ 2. 0、濃度大于或等于0.1 μg·μL-1者，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，總RNA電泳采用4.5 V·cm-1電泳強(qiáng)度，采用First Strand cDNA Synthesis Kit(上海索寶生物公司)將提取鑒定的總RNA逆轉(zhuǎn)錄，并合成cDNA，并將逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物保存于-20 ℃。

1.2.2.2 基因擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)：采用NCBI登錄GenBank，分別下載牛(Bostaurus，XM_015467111、NM_181037、NM_001076799)的nNOS、eNOS和iNOSmRNA序列，然后根據(jù)引物設(shè)計(jì)專用軟件Primer Premier 5.0在基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，設(shè)計(jì)引物序列見表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1牦牛和柴達(dá)木黃牛nNOS、eNOS和iNOS熒光定量PCR引物

Table1FluorescencequantitativePCRprimerofnNOS,eNOSandiNOSofyakandQaidamyellowcattle

基因Gene引物序列(5'→3')Primers sequence產(chǎn)物長度/bpProduct length退火溫度/℃Annealing temperaturenNOSAGCACCTTTGGCAATGGAGACCC16860GAGGAAACGCTGTTGAAACGCACCeNOSGTTCCCTCGCGTGAAGAACT19959CTGGTTGATGAAGTCCCTGGCiNOSCTTGTTCTCGAGGTGCCCAT17460GTCCCGGACTCCAACTTCTG

1.2.2.3 熒光定量PCR檢測：按照Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits (SYBR GreenⅠ) 說明書，取GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品及樣品等配制反應(yīng)體系。配好PCR反應(yīng)體系，放置于ABI7500 PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。根據(jù)ABI7500預(yù)設(shè)條件，成倍稀釋cDNA完成反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，確保樣品待測基因與內(nèi)參照基因的擴(kuò)增效率一致。

1.2.3 nNOS、eNOS和iNOS蛋白表達(dá)鑒定 采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)雙抗體夾心法測定海拔3 200 m和模擬海拔6 000 m的牦牛和柴達(dá)木黃牛CB組織中nNOS、eNOS和iNOS蛋白(美國R&D公司ELISA kit試劑盒，購自北京誼普生生物公司)。各步驟均嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。每項(xiàng)檢測均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 免疫組化染色步驟 海拔3 200 m牦牛和柴達(dá)木黃牛CB經(jīng)4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定、常規(guī)脫水、透明、包埋、連續(xù)切片，片厚4 μm，隔50取4，分成4套，其中3套分別用于nNOS、eNOS和iNOS多克隆抗體免疫組化SP法染色，另外1套進(jìn)行陰性對(duì)照。用于免疫組化染色的切片依次常規(guī)脫蠟至水、枸櫞酸修復(fù)液高壓修復(fù)、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷液孵育、非免疫動(dòng)物血清(羊) 后分別入一抗(兔源性nNOS、eNOS和iNOS多克隆抗體，1∶200，武漢博士德公司)、置冰箱4 ℃過夜、生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素-抗生物素溶液(SP試劑盒，福州邁新公司)、DAB顯色液呈色，各步驟間PBS液洗(非免疫動(dòng)物血清和一抗間不洗)、蘇木素染液復(fù)染、脫水、透明、封片。陰性對(duì)照試驗(yàn)用PBS液代替一抗。

光鏡下觀察切片，用圖象采集系統(tǒng)數(shù)碼照相，牦牛、柴達(dá)木黃牛各5頭，每頭牛CB組織取5張切片，每張nNOS、eNOS和iNOS陽性切片選取著色最深視野拍照 2～3張，每個(gè)因子共計(jì)60張。利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(德國)分析照片，計(jì)算陽性區(qū)域平均光密度值(Mean optical density，MOD)。

2 結(jié) 果

2.1 NOS基因mRNA在海拔3 200 m牦牛和柴達(dá)木黃牛CB表達(dá)差異

牦牛頸動(dòng)脈體中nNOS基因mRNA表達(dá)水平高于柴達(dá)木黃牛，而eNOS、iNOS基因mRNA表達(dá)水平分別低于柴達(dá)木黃牛，差異均不顯著(P>0.05)(表2)。

組別Group神經(jīng)型一氧化氮合成酶nNOS內(nèi)皮型一氧化氮合成酶eNOS誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶iNOS牦牛Yak2.99±2.070.97±0.541.59±0.82柴達(dá)木黃牛Qaidam yellow cattle0.60±0.241.26±0.172.97±2.41

與柴達(dá)木黃牛組比較，*.P<0.05; **.P<0.01

*.P<0.05vsQaidam yellow cattle group; **.P<0.01vsQaidam yellow cattle group

2.2 急性低氧(13.9%O2)下牦牛和柴達(dá)木黃牛HVR比較

牦牛、柴達(dá)木黃牛在常氧下(海拔3 200 m)VE分別為(46.62±13.99)和(22.76±8.97) L·min-1(P<0.01)，SaO2為(89.80±4.34)%和(85.25±6.76)% (P>0.05)；吸入低氧混合氣體(13.9% O2)后，VE分別為(50.11±13.86)和(30.20±8.29) L·min-1(P<0.01)，SaO2下降至(71.92±8.43)%和(69.66±6.18)% (P>0.05)。故低氧通氣反應(yīng)的斜率(VE的增加和SaO2下降的絕對(duì)值的比值即兩組△VE/△SaO2)分別為(0.21±0.10)和(0.50±0.21) (L·min-1)/% SaO2(P<0.01)。

2.3 急性低氧(13.9%O2)下牦牛和柴達(dá)木黃牛頸動(dòng)脈體中NOS和NO比較

由表3可知，生活在海拔3 200 m組(即常氧下)牦牛CB中nNOS、eNOS、iNOS活性和NO含量分別與柴達(dá)木黃牛的相比均沒有顯著差異(P>0.05)。在急性低氧(13.9%O2)組(模擬海拔6 000 m組)中，牦牛CB中nNOS、eNOS、iNOS活性分別與柴達(dá)木黃牛相應(yīng)值相比無顯著差異(P>0.05)，但牦牛CB中NO含量明顯高于柴達(dá)木黃牛(P<0.01)；急性低氧(13.9%O2)組的牦牛和柴達(dá)木黃牛CB中nNOS、eNOS、iNOS與海拔3 200 m組的相應(yīng)值比較，均無顯著差異(P>0.05)，而NO含量均分別明顯高于海拔3 200 m 組(P<0.01，P<0.05)。

2.4 NOS蛋白在牦牛和柴達(dá)木黃牛CB中表達(dá)的形態(tài)學(xué)差異

由圖1和表4可以看出，CB實(shí)質(zhì)由大量的圓形或橢圓形的小球密集組合而成，小球主要由分布于其外圍的“C”型并成簇排列的球細(xì)胞組成。NOS的nNOS、eNOS、iNOS蛋白在牦牛和柴達(dá)木黃牛CB中均有表達(dá)，且主要表達(dá)于CB成簇的球細(xì)胞中；牦牛nNOS和iNOS蛋白水平表達(dá)顯著高于柴達(dá)木黃牛，差異均極顯著(P<0.01)，而eNOS蛋白水平表達(dá)極顯著低于柴達(dá)木黃牛(P<0.01)。

3 討 論

平原人暴露在高原后HVR會(huì)增強(qiáng)，肺的通氣量也增大[9]。研究還表明高原世居人對(duì)HVR遲鈍[3,10-12]，Severinghaus等[11]、Lahiri和Milledge[12]分別在對(duì)玻利維亞的印第安人和喜馬拉雅的舍巴人的研究中獲得了同樣的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)外周化學(xué)感受器去敏感性可導(dǎo)致高原世居人的HVR遲鈍，這種去敏感現(xiàn)象發(fā)生于長期暴露在高原低氧環(huán)境下的幾代人當(dāng)中。楊生岳等[13]對(duì)平原移居至海拔4 750 m 20～80 d的漢族(短居組)、3～20年的漢族(久居組)和當(dāng)?shù)厥谰硬刈?世居組)進(jìn)行了HVR研究，結(jié)果表明，短居高原漢族的HVR較久居高原漢族和世居高原藏族敏感，且后兩組HVR遲鈍但無明顯差異，說明久居高原漢族的HVR也變得遲鈍，并獲得與世居高原藏族相似的HVR。但也有高原世居人對(duì)HVR并不遲鈍的報(bào)道，孫新甫等[14]對(duì)海拔3 658 m高原(拉薩)世居藏族及已習(xí)服的移居漢族的HVR進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)世居組HVR高于移居組。而格日力等[15]對(duì)居住在青藏高原海拔2 000～3 000 m (中海拔)和4 000～4 700 m (高海拔)地區(qū)藏族的低氧(12% O2)通氣反應(yīng)進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中海拔組對(duì)低氧的刺激反應(yīng)保持著較高的通氣反應(yīng)，而高海拔組則顯示鈍化，認(rèn)為高原人通氣反應(yīng)的鈍化與居住地的海拔高度有關(guān)。本次研究發(fā)現(xiàn)吸入低氧(13.9% O2)后，牦牛SaO2下降的程度略大于柴達(dá)木黃牛，且每分通氣量的增加量在牦牛和柴達(dá)木黃牛間有明顯差異，即牦牛VE增加的絕對(duì)值小于柴達(dá)木黃牛。因此，△VE/△SaO2的斜率明顯減小，說明牦牛比柴達(dá)木黃牛有著較低的HVR。

組別Group海拔3 200 m組 Altitude 3 200 m group低氧(13.9%O2)組Hypoxia(13.9%O2)groupnNOS/(ng·mL-1)eNOS/(ng·mL-1)iNOS/(pg·mL-1)NO/(nmol·mL-1)nNOS/(ng·mL-1)eNOS/(ng·mL-1)iNOS/(pg·mL-1)NO/(nmol·mL-1)牦牛Yak8.92±2.264.02±1.40205.36±29.3520.15±7.519.59±1.414.19±1.27312.25±53.2459.74±8.67**##柴達(dá)木黃牛Qaidam yellow cattle7.15±2.904.69±1.07218.15±16.949.58±2.648.29±2.023.09±0.16250.02±32.4126.08±4.74#

與柴達(dá)木黃牛組比較，**.P<0.01；與海拔3 200 m組比較，#.P<0.05, ##.P<0.01

**.P<0.01vsQaidam yellow cattle group;#.P<0.05,##.P<0.01vsaltitude 3 200 m group

A～C. 牦牛；D～F. 柴達(dá)木黃牛；A、D. nNOS；B、E. eNOS；C、F. iNOS;.小球.↑.球細(xì)胞A-C. Yak; D-F. Qaidam yellow cattle; A, D. nNOS; B, E. eNOS; C, F. iNOS;.Globule;↑.Globule cell圖1 牦牛和柴達(dá)木黃牛CB中nNOS、eNOS、iNOS蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色40×)Fig.1 The expression of nNOS, eNOS and iNOS in carotid body of yak and Qaidam yellow cattle (Immunohistochemical staining 40×)

組別Group神經(jīng)型一氧化氮合成酶nNOS內(nèi)皮型一氧化氮合成酶eNOS誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶iNOS牦牛 Yak0.20±0.02**0.18±0.02**0.27±0.04**柴達(dá)木黃牛 Qaidam yellow cattle0.16±0.020.19±0.010.19±0.01

與柴達(dá)木黃牛組比較， **.P<0.01

**.P<0.01vsQaidam yellow cattle group

一般認(rèn)為HVR的減弱與CB的結(jié)構(gòu)或生化改變有關(guān)。Donovan等[16]研究發(fā)現(xiàn)BN大鼠在低氧環(huán)境下表現(xiàn)出較低的急性通氣反應(yīng)，而SD大鼠呈現(xiàn)較高的通氣反應(yīng)，但BN大鼠TH陽性和nNOS陽性區(qū)域均大于SD大鼠。Ⅰ型細(xì)胞中線粒體被認(rèn)為與CB氧感受有關(guān)，我們先前的研究表明牦牛Ⅰ型細(xì)胞線粒體數(shù)量明顯少于柴達(dá)木黃牛[8]，牦牛也有著比柴達(dá)木黃牛較低的HVR。另外，在常氧下(海拔3 200 m)牦牛通氣量(46.62±13.99) L·min-1，顯著大于柴達(dá)木黃牛的(22.76±8.97) L·min-1，這也可能是牦牛比柴達(dá)木黃牛有著較低HVR的原因之一。

急性氧感受是個(gè)體在低氧狀態(tài)下生存的必要條件。CB是主要的外周化學(xué)感受器，其含調(diào)節(jié)離子通道含有的易興奮和氧敏感的球細(xì)胞。機(jī)體暴露于急性低氧環(huán)境下，K+通道的抑制是觸發(fā)細(xì)胞去極化、神經(jīng)遞質(zhì)釋放和刺激腦干呼吸中樞產(chǎn)生超通氣的感覺纖維激活信號(hào)。最新的研究表明[17]，大鼠兩側(cè)CB去神經(jīng)后5周，呼吸節(jié)奏緩慢而不規(guī)律，10周后呼吸頻率與假手術(shù)組間無差異，但呼吸節(jié)奏的規(guī)律性仍然在減少。增加隨機(jī)呼吸暫停的頻率可能是CB去神經(jīng)后產(chǎn)生不規(guī)則呼吸模式的原因。在常氧下NO能增加去化學(xué)感受效應(yīng)，而在低氧條件下，NO是CB化學(xué)感受的主要抑制調(diào)節(jié)器，它直接調(diào)節(jié)球細(xì)胞和巖神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的興奮性，間接調(diào)節(jié)血管緊張性和氧傳遞[18]。Fung等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在低氧狀態(tài)下大鼠CB中內(nèi)源性NO生成增多，NO的升高可抑制頸動(dòng)脈化學(xué)感受器對(duì)低氧的反應(yīng)。NOS催化L-精氨酸而生成NO。Valdés等[20]報(bào)道，在貓CB中nNOS和eNOS都參與NO的生成，但eNOS是NO的主要來源，并且加強(qiáng)化學(xué)感受活動(dòng)。本研究中，海拔3 200 m(常氧下)，牦牛頸動(dòng)脈體中nNOS基因mRNA和蛋白表達(dá)水平、NO含量均高于柴達(dá)木黃牛，而eNOS、iNOS基因mRNA和蛋白表達(dá)水平分別低于柴達(dá)木黃牛，但差異均不顯著(P>0.05)；免疫組化的研究結(jié)果表明牦牛CB中nNOS也高于柴達(dá)木黃牛(P<0.01)， eNOS蛋白水平表達(dá)也低于柴達(dá)木黃牛(P<0.01)，但iNOS蛋白水平表達(dá)卻高于柴達(dá)木黃牛(P<0.01)，說明牦牛CB中nNOS、eNOS蛋白含量最高區(qū)域的平均光密度值均高于柴達(dá)木黃牛，而iNOS蛋白含量最高區(qū)域的平均光密度值低于柴達(dá)木黃牛。急性低氧(13.9% O2)組(模擬海拔6 000 m)牦牛和柴達(dá)木黃牛CB中nNOS、eNOS、iNOS活性分別大于海拔3 200 m 組，相應(yīng)指標(biāo)差異均不顯著(P> 0.05)，而NO含量則顯著高于海拔3 200 m組(P<0.01，P<0.05)，并且在急性低氧(13.9%O2)(模擬海拔6 000 m) 狀態(tài)下，牦牛頸動(dòng)脈體中NO含量極顯著高于柴達(dá)木黃牛(P<0.01)，可見急性低氧可導(dǎo)致牦牛和柴達(dá)木黃牛CB中產(chǎn)生大量NO，且牦牛明顯多于柴達(dá)木黃牛。綜上所述，在急性低氧條件下牦牛CB中高含量的NO阻止了CB對(duì)低氧的感受，同時(shí)鈍化了牦牛的HVR。

4 結(jié) 論

青藏高原世居牦牛低氧通氣反應(yīng)鈍化，而柴達(dá)木黃牛對(duì)低氧的刺激保持較高的通氣反應(yīng)，急性低氧時(shí)牦牛CB內(nèi)產(chǎn)生大量的NO可抑制對(duì)低氧的化學(xué)感受。