孟凡飛，孟凡娜，熊 琦，羅小舸 綜述，蒲曉允△ 審校

(1.中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院檢驗科，重慶 400037； 2.中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院健康體檢中心，重慶 400038)

核酸適配體是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(SELEX)體外篩選獲得的，是一個短的單鏈脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)分子[1]。核酸適配體通過分子內(nèi)的相互作用折疊形成特定的三維結(jié)構(gòu)而與靶標分子特異性結(jié)合，其功能類似于抗體，因此核酸適配體被人們稱為“化學抗體”。除此之外，適配體還擁有很多抗體無法比擬的優(yōu)勢，例如易修飾、可體外篩選、配體廣泛和無免疫原性等[2]。由于適配體相對分子質(zhì)量遠遠小于抗體或酶等其他生物識別分子，因此，在制造生物傳感器方面被認為是理想的分子識別元件，憑借自身優(yōu)良特性，適配體被廣泛應用于環(huán)境監(jiān)測、生物醫(yī)學診斷和國土安全等領域。近年來，各種各樣的DNA生物傳感器先后被研發(fā)報道，包括熒光技術、表面等離子體共振光譜、電化學發(fā)光法、電化學等，電化學傳感器因為低背景，操作簡單，響應速度快，靈敏度高，小型化，成本效益相對較低等特點，在生物傳感器的發(fā)展中引起研究者極大的關注。本文結(jié)合近幾年電化學適配體傳感器的文獻報道，對非標記型適配體傳感器常用的檢測方法和標記型適配體傳感器標記物的不同進行綜述，旨在為后續(xù)研究者在相關領域的深入研究提供參考和指導，現(xiàn)綜述如下。

1 適配體生物傳感器簡介

生物傳感器技術是檢測領域發(fā)展最快的技術之一，生物傳感器是由被分析物和傳感器裝置之間的化學相互作用而產(chǎn)生的一種裝置，可將定量或定性類型的化學或生化信息轉(zhuǎn)化為有用的分析信號[3]。電化學生物傳感器是由生物識別元件和信號轉(zhuǎn)換元件組成，可將生物分子和靶分子的相互作用轉(zhuǎn)變成電流或電位的形式表現(xiàn)出來。常用的生物識別元件有抗體、酶和核酸探針。幾種生物識別元件中，由于酶的特異結(jié)合能力及生物活性，在電化學生物傳感器中應用較為廣泛，電化學生物傳感器可以通過電位、電荷積累、電流、電導或阻抗來量化溶液中的靶分子水平。一般來說，電化學生物傳感器可分為電流、阻抗、電位、電導傳感器[4]。電化學傳感器的靈敏度和選擇性主要取決于生物識別元件，近年適配體作為生物識別元件已成為電化學傳感器研究的熱點，核酸適配體具有較高穩(wěn)定性，結(jié)構(gòu)簡單，易于修飾，可長期保存，被稱為最實用的生物傳感器識別元件[5]。

電化學適配體傳感器，以適配體與目標物特異性結(jié)合為基礎，將核酸適配體作為識別元件或檢測對象，通過換能器的作用使發(fā)生在適配體分子特異性識別中產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)化為電學信號[6]。首先通過吸附、共價鍵結(jié)合、自組裝等方法，將核酸適配體固定于表面功能活化的電極表面，適配體的固定化效果與電極表面功能化策略的選擇有直接關系，應盡量降低位阻現(xiàn)象的影響，適配體與目標物結(jié)合后改變了電極表面結(jié)構(gòu)，電化學信號發(fā)生變化，根據(jù)電化學信號的變化進行目標物的定量檢測。按檢測方式的不同，電化學適配體生物傳感器同樣可分為電導型、電流型、電容型、電位型和阻抗型。根據(jù)是否應用標記物產(chǎn)生檢測信號，電化學適配體傳感器又可分為標記型與非標記型兩大類[7]。電化學適配體生物傳感器具有檢測速度快，靈敏度高，特異性強，簡單便攜，成本效益相對較低和微型化等特點，是一個極具發(fā)展?jié)摿Φ姆治龉ぞ摺?/p>

2 非標記型電化學適配體傳感器

非標記型電化學傳感器的適配體探針不需要標記電活性物質(zhì)，適配體和靶分子之間的相互作用被直接監(jiān)控，沒有任何標簽的存在。在電化學傳感器的制備中，適配體的固定化是關鍵的一步。方案設計中需要注意的是非特異性結(jié)合降低、親和性的丟失及適配體的易接近[8]。適配體與靶標結(jié)合后，發(fā)生構(gòu)象或空間位阻的改變，根據(jù)電極表面電化學信號的改變實現(xiàn)對靶分子的定量檢測。常用的非標記電化學適配體傳感器的檢測方法為阻抗法、伏安法、安培法等，下面根據(jù)檢測方法的不同做簡單介紹。

2.1阻抗法檢測 阻抗法適配體傳感器是根據(jù)核酸適配體與靶物質(zhì)形成的復合結(jié)構(gòu)導致電極表面電荷的通透性發(fā)生變化而進行檢測，根據(jù)實驗設計的不同可分為阻抗增加型和阻抗減小型2種。BENVIDI等[9]研制了一種簡單、可再生的電化學生物傳感器，設計探針序列較短，且與目標DNA部分序列互補，將其固定于金電極表面，目標DNA和核苷酸及酶在適當時間加入，設計探針和目標DNA雜交，在酶的作用下設計探針得以延伸，熱變性處理后，僅剩延伸的設計探針留在電極表面，研究發(fā)現(xiàn)該傳感器檢測中交流阻抗法分析性能優(yōu)于差分脈沖伏安法，交流阻抗法檢測范圍為1.0 × 10-19～1.0 × 10-7mol/L，檢出限為4.6 × 10-20mol/L。陳秋香等[10]將氨基化的腺苷適配體固定在已活化的電極表面，適配體與腺苷結(jié)合后會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，另外設計一條發(fā)卡探針，其環(huán)部可與適配體發(fā)卡結(jié)構(gòu)的環(huán)部堿基互補雜交，通過環(huán)-環(huán)相互作用形成一個“親吻型適配體復合物”使電極的阻抗信號明顯變大，將電阻值作為響應信號可以定量測定腺苷，傳感器線性檢測范圍為5～1 000 nmol/L，檢出限為0.6 nmol/L。與之前所述不同，CAI等[11]分別用丙烯酰胺聚合物修飾發(fā)夾DNA H3和H4，合成了2種不同的共聚物鏈P1和P2，當Mg2+存在時，Hg2+可以激活Mg2+特異脫氧核酶，后者可選擇性部分水解核糖堿基修飾的底物，局部基鏈從脫氧核酶上解離出來，與設計探針H1雜交暴露其隱藏的序列，引發(fā)共聚物鏈P1和P2中發(fā)卡DNAH3和H4的雜交鏈反應，因此在電極表面組裝出一層DNA交聯(lián)的水凝膠，極大阻礙了電極表面電子傳遞。該阻抗傳感器對Hg2+具有高靈敏度和選擇性，線性檢測范圍為0.1 pmol/L～10.0 nmol/L，檢出限為0.042 pmol/L。阻抗型適配體電化學傳感器穩(wěn)定性好、抗干擾能力強、線性范圍較寬，對成分較復雜的樣本檢測更能體現(xiàn)其優(yōu)越性，具有良好的應用前景。

2.2伏安法檢測 在電化學生物傳感器中，伏安技術包括循環(huán)伏安法(CV)、差分脈沖伏安法(DPV)、方波伏安法(SWV)和交流伏安法(ACV)，相應的電流是在工作電極上通過電化學氧化還原而電解的結(jié)果。伏安法適配體傳感器通常是將適配體直接或間接固定于電極表面，靶物質(zhì)與適配體結(jié)合后，適配體發(fā)生構(gòu)像變化，導致電極表面電活性物質(zhì)增加或減少，使電活性信號發(fā)生改變。WEI等[12]制備了一種高靈敏檢測鏈霉親和素的電化學生物傳感器，信號鏈DNA的3′末端用CdSe量子點標記，在5′末端用生物素標記，與信號鏈DNA互補的捕獲鏈DNA5′末端用巰基標記，鏈霉親和素與信號鏈DNA結(jié)合后，可以阻礙其與捕獲鏈DNA的結(jié)合，用微分脈沖陽極溶出伏安法檢測電極表面的CdSe量子點可以間接檢測鏈霉親和素的水平，該傳感器的檢測范圍為1.96 pg/mL～1.96 μg/mL，檢出限可達0.65 pg/mL。LI等[13]構(gòu)建了一個基于羧基化石墨烯和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的適配體傳感器。先將羧基化的石墨烯沉積在GCE表面用于增加比表面積和導電性，富含肽的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸通過共價結(jié)合也被固定于電極表面，用以增加羧基化石墨烯的生物相容性，隨后在修飾完畢的電極表面沉積納米金，增加導電性。巰基化肌紅蛋白適配體通過金巰鍵結(jié)合于電極表面，肌紅蛋白加入后，肌紅蛋白與適配體特異性結(jié)合，阻礙了電極表面電子傳遞，根據(jù)電化學信號的變化采用DPV可以定量測定樣品中肌紅蛋白的水平。該傳感器具有很好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，抗干擾能力強，檢測的線性范圍為0.000 1～0.200 0 g/L，檢出限可達26.300 0 ng/mL。

GAO等[14]研制了一個檢測凝血酶的夾心型電化學傳感器，巰基化的適體1被固定在金電極上捕捉凝血酶分子，然后核酸適配體2固定于納米鉑/碳納米籠表面，納米鉑作為過氧化氫模擬酶，催化還原H2O2，放大了電化學信號。YAN等[15]將干擾素-γ(IFN-γ)適配體與石墨烯混勻，在疏水作用力和π-π共軛鍵作用下結(jié)合形成復合物，再用16-巰基十六烷酸修飾金電極表面形成疏水的自組裝膜，由于復合物間較強的π-π共軛鍵，使其不能組裝到覆蓋了自組裝膜的電極表面。存在IFN-γ和脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)時，IFN-γ結(jié)合并分離出復合物中的適配體，DNase Ⅰ可以裂解適配體并分離出IFN-γ，從而起到循環(huán)放大的作用，“裸”石墨烯可以通過疏水作用和π鍵結(jié)合到自組裝膜上，電極表面產(chǎn)生電活性信號，因此可以對IFN-γ進行定量檢測。該傳感器方案新穎，靈敏度高，檢測的IFN-γ線性范圍為0.1～0.7 pmol/L,檢出限可達0.065 pmol/L。

伏安法傳感器的一個顯著優(yōu)點是觀察到的相關噪聲低，從而為目標分子的定量提供可靠的、可重復的數(shù)據(jù)，從而賦予生物傳感器更高的靈敏度和更強的特異性。由于方法學限制，伏安法靈敏度相對于阻抗法偏低，但是伏安法可以對多個具有不同的峰電位化合物同時檢測，在一次電化學實驗中同時檢測多種分析物，這是阻抗法傳感器不能實現(xiàn)的?？傊卜ㄟm配體電化學傳感器制作簡單、穩(wěn)定性好、檢出限低，是近年比較熱門的研究方向。

2.3安培法檢測 安培生物傳感器可以被認為是伏安生物傳感器的一個子類，施加一個恒定的電位下工作，該恒定電位是工作電極相對于參比電極而言，監(jiān)視電流的變化相對于時間的函數(shù)。安培法適配體傳感器是通過適配體與靶物質(zhì)結(jié)合后，直接或間接影響底物液中電流的產(chǎn)生。

盧瑩等[16]設計了一條與腺苷三磷酸(ATP)適配體序列互補的短鏈 DNA探針，并通過Au-S鍵自組裝將其固定在電極表面，ATP的核酸適配體與該DNA探針雜交而結(jié)合在電極表面。雜交雙鏈DNA通過靜電吸引可以結(jié)合電解液中的六氨合釕(RuHex)陽離子。當ATP與核酸適配體結(jié)合后，使適配體鏈從電極表面解離，電極表面DNA量減少，結(jié)合RuHex的量也隨之降低，通過計時安培法檢測RuHex響應信號的降低，從而對ATP進行定量測定。傳感器線性檢測范圍為0.001～100.000 μmol/L，檢出限為0.5 nmol/L。該傳感器設計方案具有普適、簡單、易于再生線性的特點。

RASHEED等[17]研制了一種基于石墨烯的電化學DNA傳感器，用于乳腺癌相關基因BRCA1的低水平檢測。DNA傳感器采用“三明治”的檢測策略，氨基化的設計探針DNA-c固定于石墨烯電極表面，目標基因DNA-t和標記了納米金的信號探針DNA-r通過堿基互補雜交，固定于電極表面，根據(jù)電極表面納米金的電化學氧化信息用循環(huán)伏安法和計時電流法檢測目標基因DNA-t的水平，該傳感器靈敏度、穩(wěn)定性、重復性均較好，它可以檢測到1 fmol/L的BRCA1基因。

此外，安培法還被應用于其他傳感器的測定，有學者研制了一種功能性二氧化硅/木質(zhì)素酶混合材料的廉價生物傳感器，分別采用循環(huán)伏安法和計時安培法檢測葡萄糖的水平，使傳感器的性能得到驗證[18]。劉美梅等[19]采用一鍋法制備鈀銅納米材料，采用計時安培法對復合納米材料的電化學性能進行分析，證實了其具有良好的乙醇電催化性能。

3 標記型電化學適配體傳感器

標記型電化學適配體傳感器是將一些具有電活性或催化活性的功能性標記物通過物理吸附、化學修飾等方法標記在適配體探針末端，核酸適配體與靶分子特異性結(jié)合后，發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)換，標記物因適配體形狀變化而發(fā)生位置改變，檢測到的電化學信號也發(fā)生變化。常用的功能性標記物有MB、Fc、納米材料、生物酶等。根據(jù)功能性標記物的不同，標記型電化學適配體傳感器可分為電活性分子標記型、酶標記型和納米材料標記型等。

3.1電活性分子標記型適配體傳感器 電活性分子標記型適配體傳感器是采用電活性物質(zhì)標記適配體，常用的電活性標記物有MB、Fc等。

DINSHAW等[20]提出了一個創(chuàng)新的策略，利用還原石墨烯-殼聚糖的復合材料作為導電基底，檢測整個鼠傷寒沙門菌細胞的適配體傳感器。使用戊二醛交聯(lián)劑將標記了MB和巰基化的沙門菌外膜蛋白適配體固定在復合材料上，通過檢測MB信號降低程度可以測定標本中鼠傷寒沙門菌細胞水平，該傳感器對鼠傷寒沙門菌檢測限可達到10 CFU/mL，使用人工加工的生雞肉樣品進行測試，其結(jié)果與純細胞培養(yǎng)液的靈敏度結(jié)果一致。BAO等[21]將標記了MB的設計探針固定在金電極表面，標記了Fc的凝血酶適配體(TBA)，與設計探針通過堿基互補形成雜交雙鏈，使Fc靠近電極表面，產(chǎn)生相應電信號，凝血酶和核酸外切酶(RecJf)加入反應體系后，凝血酶特異性結(jié)合TBA并使之與設計探針分離，在RecJf作用下TBA被分解，凝血酶重新結(jié)合雜交雙鏈中的TBA，使更多的設計探針釋放出來，存在適量Mg2+的情況下，設計探針形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)而使MB靠近電極表面，采用DPV對電信號的改變進行凝血酶水平定量檢測，此法檢測凝血酶的響應范圍為5 pmol/L～50 nmol/L，檢出限可達0.9 pmol/L。該傳感器具有靈敏度高、穩(wěn)定性好和特異性強的特點。

3.2酶標記型適配體傳感器 酶具有高的催化效率和嚴格的催化專一性，近年來在適配體傳感器中的應用也較為廣泛。酶標記型適配體傳感器是將有催化作用的酶通過特定方法標記到核酸上適配體上，酶可催化底物發(fā)生反應，電化學信號被有效放大。常用的酶有堿性磷酸酶、葡萄糖脫氫酶、辣根過氧化物酶等[22-24]。

IKEBUKURO等[23]構(gòu)建了“三明治”夾心結(jié)構(gòu)的適配體傳感器，這種傳感器僅適用于具有兩個結(jié)合位點的適配體，例如凝血酶，將適配體1固定在金電極表面，當凝血酶存在時，修飾了葡萄糖脫氫酶的適配體2可與凝血酶和適配體1形成夾心結(jié)構(gòu)。在葡萄糖脫氫酶作用下，葡萄糖脫氫變成葡萄糖酸，電流產(chǎn)生，根據(jù)電極表面電信號的改變對凝血酶進行定量檢測。與之相類似，HUANG等[22]采用一步還原法合成了Fe3O4@Au復合磁性納米粒子，然后用人抗IgE抗體包裹復合磁性納米粒子，在hIgE存在時，修飾了生物素的hIgE適配體、hIgE可與人抗IgE抗體形成夾心結(jié)構(gòu)而固定于復合磁性納米粒子上，修飾了親和素的堿性磷酸酶可以與hIgE適配體的生物素基團結(jié)合，體系中加入維生素C磷酸酯和硝酸銀混合溶液后，堿性磷酸酶作用下維生素C磷酸酯產(chǎn)生抗壞血酸，抗壞血酸可使溶液中的Ag+沉積在Fe3O4@Au復合物表面，采用電化學方法可以對單質(zhì)銀進行定量檢測，單質(zhì)銀的氧化電流的大小與體系中的hIgE的水平相關。該傳感器設計巧妙，靈敏度和特異度均較高，整個反應體系均在反應液中，穩(wěn)定性高。但操作較為復雜，不易于推廣。 LIU等[24]制備了一種新的夾心型電化學傳感器用以檢測抗菌藥物土霉素。該傳感器是基于三維結(jié)構(gòu)的石墨烯納米金和辣根過氧化物酶-適配體-納米金作為信號標簽。石墨烯納米金修飾電極能提高電子轉(zhuǎn)移和生物承載力，納米金和酶修飾適配體增加了適配體和土霉素的親和力并反應放大了電流信號，優(yōu)化條件下，峰電流與土霉素在5×10-10～2×10-3g/L的水平范圍內(nèi)呈線性關系，檢測限可達4.98×1010g/L。

3.3納米材料標記型電化學適配體傳感器 納米材料具有獨特的表面效應、特殊的理化特性、良好的生物相容性和優(yōu)異的導電性能，可以明顯提高生物傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性，成為當前的熱點研究領域。常見的納米材料包括碳納米管材料(石墨烯、碳納米管等)、金屬納米材料(納米鉑、納米金、納米銀等)和其他納米材料(量子點、上轉(zhuǎn)換材料)等。碳納米管材料表面積大、導電性好、韌性好，常被用作基材平鋪于電極表面，增加傳感器靈敏度。金屬納米材料和碳納米管具有催化效率高，導電能力強，比表面積大和良好的生物相容性，常被用于固定適配體生物分子，增加固定量。量子點又稱半導體納米微晶粒，由于其具有良好的光電性能且穩(wěn)定性好，近年在電化學發(fā)光傳感器設計中被廣泛應用。

WANG等[25]合成了納米金-石墨烯復合物和銅鈀納米復合物，采用“三明治夾心”策略構(gòu)建傳感器檢測凝血酶，巰基化凝血酶適配體1固定于電極表面的納米金-石墨烯復合物上，銅鈀納米復合物標記的凝血酶適配體2和凝血酶與適配體1形成夾心結(jié)構(gòu)，銅鈀納米復合物可催化底液中的H2O2發(fā)生還原反應，從而引起電極表面電流改變。采用循環(huán)伏安法檢測，傳感器對凝血酶的檢測范圍為0.01～2.00 ng/mL，檢出限可達5 pg/mL。該傳感器使用了新穎的銅鈀納米復合材料標記適配體，催化氧化還原反應的發(fā)生，具有選擇性好、重現(xiàn)性好的特點。GHANBARI等[26]將巰基的石墨烯量子點固定在電極表面，隨后在電極表面鍍納米金，巰基化的鏈霉素適配體通過金巰鍵固定于電極表面，鏈霉素識別并結(jié)合適配體，電極表面信號發(fā)生相應變化，該傳感器具有較寬的檢測范圍為0.1～700.0 pg/mL。 該傳感器已被成功地應用于實際樣品的測定，并取得了令人滿意的結(jié)果。

除此之外，基于量子點本身的熒光信號構(gòu)建的電化學發(fā)光傳感器也較為常見，BALA等[27]利用CdTe@SiO2量子點，制備了用于檢測馬拉硫磷的熒光傳感器，實驗證明，該傳感器靈敏度較高，馬拉硫磷的檢出限可達4 pmol/L。HUANG等[28]將足量的巰基修飾后ATP適配體固定到預處理的金電極表面，加入ATP溶液后形成適配體-ATP生物親和性復合物，與適配體互補的修飾了生物素的DNA寡核苷酸(cDNA)與適配體雜交，親和素修飾的量子點通過生物素-親和素結(jié)合而被固定到cDNA上，cDNA與ATP競爭結(jié)合適配體，該傳感器檢測的量子點 ECL信號與ATP水平呈反比。

綜上所述，電化學適配體傳感器具有檢出限低，靈敏度高，特異性強的特點，且小型化、微型化的電化學傳感設備，是現(xiàn)場快速檢測較為理想的檢測裝置。與標記型電化學傳感器相比，非標記型具有操作簡單、無需標記、對靶分子影響小和低污染等優(yōu)點，因此從實際應用意義出發(fā)，非標記性電化學傳感器優(yōu)勢較大。納米技術的不斷成熟，尤其是復合納米材料的出現(xiàn)，使適配體傳感器設計策略得到優(yōu)化，為電化學適配體傳感技術的發(fā)展起到了積極的推動作用。

適配體傳感器發(fā)展的瓶頸主要有以下幾點：(1)適配體相比抗體優(yōu)勢明顯，但適配體的篩選及驗證較為繁瑣，特別是當靶分子帶有負電荷或疏水性較強時，目前確定的適配體種類有限。(2)各種電化學適配體傳感器均在實驗理想條件下展現(xiàn)出良好的性能，實驗條件和周圍環(huán)境發(fā)生變化，直接影響到適配體的穩(wěn)定性，以及適配體與靶物質(zhì)的結(jié)合效率，這也是適配體傳感器策略能否設計成功的關鍵因素。(3)實驗室檢驗中往往涉及血液、尿液、分泌物等復雜生物標本，而電化學適配體傳感器尤其是非標記型的抗干擾能力差，因此對標本的預處理環(huán)節(jié)十分必要。

盡管當代學者在適配體傳感器的研究上取得了一些成績，但適配體傳感器應用于實際臨床樣本分析仍存在很多問題，面臨著很多挑戰(zhàn)。隨著科技的進步，研究的深入，這些難題終究會被攻克，適配體傳感器技術將會滿足實際分析的要求，在醫(yī)療、衛(wèi)生、環(huán)境檢測等領域得到更為廣泛的應用。