高 強(qiáng)，李政委，李大進(jìn)，朱炳鑫，秦海輝

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州兒童醫(yī)院創(chuàng)傷外科 221006)

膿毒癥為創(chuàng)傷外科常見(jiàn)的全身炎性反應(yīng)綜合征，發(fā)病率較高，可誘發(fā)器官衰竭綜合征，嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致死亡[1]。膿毒癥并非僅僅是過(guò)度炎性反應(yīng)，它是炎性反應(yīng)和抗炎反應(yīng)相互作用過(guò)程中機(jī)體免疫功能紊亂的結(jié)果。膿毒癥病程進(jìn)展過(guò)程中，涉及機(jī)體多種免疫細(xì)胞之間平衡的失調(diào)和免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的紊亂。兒童由于自身免疫功能尚不完善，在發(fā)生嚴(yán)重創(chuàng)傷時(shí)，更易由感染誘發(fā)膿毒癥，造成嚴(yán)重后果。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)是T淋巴細(xì)胞的一個(gè)亞群，具有強(qiáng)大的免疫抑制功能，是維持人體免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)不可或缺的一部分。曾一度被認(rèn)為僅存在于胸腺來(lái)源的CD4+Foxp3+T細(xì)胞之中的轉(zhuǎn)錄因子Helios在Tregs中呈高水平表達(dá)[2-3]。Helios是維持CD4+Foxp3+T細(xì)胞穩(wěn)定抑制能力所不可或缺的角色[4]，同時(shí)是具有抑制功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的標(biāo)記物[5-6]。既往研究表明，Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達(dá)比例在多種免疫相關(guān)的疾病中扮演了重要角色，但其在兒童創(chuàng)傷后膿毒癥中的作用鮮有報(bào)道[7-11]。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)創(chuàng)傷膿毒癥患兒外周血中Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達(dá)比例的變化，分析Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達(dá)比例與相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平間的潛在關(guān)系，探討Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達(dá)比例在兒童創(chuàng)傷膿毒癥中的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院2015年1月至2017年6月收治的60例創(chuàng)傷膿毒癥患兒納入膿毒癥組，經(jīng)病原學(xué)及影像學(xué)檢查確診，符合2005年國(guó)際兒科膿毒癥年會(huì)所制定的小兒膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，其中男36例，女24例；平均(8.56±2.33)歲。選擇同期入院但未發(fā)生膿毒癥的60例創(chuàng)傷兒童納入創(chuàng)傷組，其中男32例，女28例；平均(9.21±3.12)歲。同期本院60例健康體檢者納入對(duì)照組，其中男30例，女30例；平均(8.94±2.79)歲。所有研究對(duì)象排除標(biāo)準(zhǔn)：患有自身免疫疾病、嚴(yán)重的慢性疾病、或是長(zhǎng)期服用糖皮質(zhì)激素的兒童。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過(guò)后進(jìn)行，所有研究對(duì)象監(jiān)護(hù)人均對(duì)本研究知情同意。

1.2方法 所有研究對(duì)象均空腹8 h后抽取靜脈血2 mL于肝素抗凝管內(nèi)，室溫靜置30 min后以300×g速度離心7 min，分離上層血漿，分裝保存于-80 ℃冰箱內(nèi)待測(cè)。用淋巴細(xì)胞分離液對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行密度梯度離心，分離得到單核淋巴細(xì)胞；對(duì)單核淋巴細(xì)胞進(jìn)行特異性抗體染色后進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，并采用Flowjo V10軟件進(jìn)行流式數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)檢測(cè)血漿中細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1的水平。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，檢測(cè)外周血單核淋巴細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Helios及Foxp3的mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.13組研究對(duì)象Tregs比例檢測(cè)結(jié)果比較 膿毒癥組、創(chuàng)傷組及對(duì)照組外周血中轉(zhuǎn)錄因子Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達(dá)比例分別為(85.37±11.25)%、(66.56±10.86)%、(63.72±9.88)%，膿毒癥組明顯高于創(chuàng)傷組、對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。膿毒癥組、創(chuàng)傷組及對(duì)照組外周血CD4+Foxp3+Tregs細(xì)胞比例分別為(7.90±1.31)%、(6.88±1.02)%、(2.79±0.31)%，膿毒癥組和創(chuàng)傷組明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，膿毒癥組與創(chuàng)傷組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.23組研究對(duì)象血漿IL-10、TGF-β1水平比較 ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，膿毒癥組、創(chuàng)傷組及對(duì)照組血漿中IL-10水平分別為(25.46±3.67)、(20.51±2.91)、(17.47±0.89)pg/mL，膿毒癥組明顯高于創(chuàng)傷組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。膿毒癥組、創(chuàng)傷組及對(duì)照組血漿中TGF-β1水平分別為(45.26±8.62)、(41.81±7.11)、(33.79±6.97)pg/mL，膿毒癥組明顯高于創(chuàng)傷組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達(dá)比例與血漿IL-10、TGF-β1水平相關(guān)性分析 IL-10(r=0.627，P=0.001)、TGF-β1(r=0.638,P=0.001)與外周血中Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達(dá)比例間呈顯著正相關(guān)。

2.43組研究對(duì)象外周血單核淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Helios及Foxp3的mRNA表達(dá)水平比較 膿毒癥組、創(chuàng)傷組及對(duì)照組外周血單核淋巴細(xì)胞Helios的mRNA表達(dá)水平分別為4.88±1.77、3.21±1.29、0.96±0.18，膿毒癥組明顯高于創(chuàng)傷組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。膿毒癥組、創(chuàng)傷組及對(duì)照組Foxp3的mRNA水平分別為3.76±1.30、3.68±1.21、0.87±0.15，膿毒癥組及創(chuàng)傷組明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但膿毒癥組與創(chuàng)傷組之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

2001年美國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)等多個(gè)相關(guān)組織在華盛頓召開(kāi)會(huì)議，將膿毒癥定義為由微生物引起的全身炎性反應(yīng)綜合征[1]。美國(guó)每年約75萬(wàn)人發(fā)生膿毒癥，病死率為20%～60%；我國(guó)每年也有大量膿毒癥患者，死亡人數(shù)近百萬(wàn)。兒童患者免疫功能尚未發(fā)育健全，病情進(jìn)展迅速，更應(yīng)引起重視。膿毒癥發(fā)生時(shí)機(jī)體炎癥細(xì)胞激活，引其自身系統(tǒng)性炎性反應(yīng)。Tregs是T細(xì)胞的組成部分，在抑制炎性反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，Tregs數(shù)量異?；蚴枪δ芙档途赡軐?dǎo)致機(jī)體免疫功能失調(diào)，導(dǎo)致疾病發(fā)生。Tregs通過(guò)產(chǎn)生IL-10抑制Teffs激活及后續(xù)一系列的免疫炎性反應(yīng)[12-13]，并通過(guò)分泌TGF-β1抑制其他T細(xì)胞的作用，阻礙輔助T細(xì)胞及細(xì)胞毒性T細(xì)胞的激活[14-16]。Foxp3曾被認(rèn)為是Tregs標(biāo)記物[11,17-18]，然而進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3既表達(dá)于具有抑制功能的Tregs，也可以出現(xiàn)在效應(yīng)性T細(xì)胞中[19-20]。

Helios是屬于Ikaros家族的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，近期研究認(rèn)為Helios是具有抑制功能的Tregs的標(biāo)記物[5-6]，本研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷膿毒癥患兒外周血中Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達(dá)比例相對(duì)于創(chuàng)傷組和對(duì)照組明顯升高，且血漿細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1與Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達(dá)比例存在顯著正性相關(guān)關(guān)系。細(xì)胞因子IL-10是人類(lèi)細(xì)胞因子的合成抑制因子，是具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用的細(xì)胞因子，被視作Tregs標(biāo)記物之一，研究證實(shí)，Tregs通過(guò)產(chǎn)生IL-10從而抑制Teffs激活及免疫炎性反應(yīng)。TGF-β1是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族成員，它承載多項(xiàng)細(xì)胞功能，包括調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，細(xì)胞分化凋亡等。Tregs能夠分泌TGF-β1，進(jìn)一步抑制其他T細(xì)胞效應(yīng)功能，從而抑制免疫炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達(dá)水平同以上兩種細(xì)胞因子的表達(dá)水平之間存在正相關(guān)關(guān)系，由此筆者猜測(cè)，過(guò)度表達(dá)的Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達(dá)比例可能在創(chuàng)傷膿毒癥患兒疾病進(jìn)展中產(chǎn)生了潛在的影響，抑制了機(jī)體的正常免疫炎性反應(yīng)，導(dǎo)致疾病病程進(jìn)展，但其具體作用機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。