劉晴晴，魏碧玉，任鵬，劉永哲，郭航，孫立，郭文治，馬亞群，高明龍

芬太尼作為強效阿片類鎮(zhèn)痛藥，是目前復合全身麻醉的常用藥物[1]，但是長期暴露于阿片類藥物中會出現疼痛敏感性增加、痛閾下降的現象，即阿片類藥物誘導的痛覺過敏(opioid induced hyperalgesia，OIH)[2-3]。目前，OIH的形成機制還不明確，獲廣泛認可的有兩種假設[4]：一種是系統(tǒng)的下行易化，包括谷氨酸轉運體的下調、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的激活以及星形膠質細胞的活化；在神經性或者炎性疼痛中，業(yè)已證明脊髓背角的星形膠質細胞和小膠質細胞參與其中[5]。另一種是細胞水平的適應，包括脫敏、內化和異化等，比如誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的異化。Célérier等[6]發(fā)現iNOS在痛覺過敏中扮演著重要的角色，阿片類藥物暴露引起的痛覺過敏在敲除iNOS基因的小鼠中明顯下降；Tao等[7]也發(fā)現，在神經性或炎性疼痛模型中NDMA受體的過度興奮似乎與脊髓iNOS-NO通路激活有關。

右美托咪定作為α2腎上腺素受體(alpha-2 adrenergic-receptor，α2-AR)激動劑參與了痛覺的調控[8-10]，研究發(fā)現右美托咪定可以抑制星形膠質細胞[11]、小膠質細胞[12]的活化，從而減少炎性介質iNOS等的產生。雖然有研究表明右美托咪定可以降低痛覺過敏的發(fā)生率[13]，但關于右美托咪定對OIH調控機制的報道尚少。本研究旨在觀察提前給予右美托咪定對芬太尼誘導的痛覺過敏的影響，通過測定大鼠模型中脊髓后角區(qū)域α2A腎上腺素受體(alpha-2A adrenergic-receptor，α2A-AR)、iNOS、P物質、星形膠質細胞標志物膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和小膠質細胞標志物離子鈣接頭蛋白1(ionized calcium binding adaptor molecule 1，Iba-1)的表達變化來探索其中可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 130只雄性SPF級SD大鼠，2～3月齡，體重(260±20)g，由斯貝福(北京)實驗動物有限公司提供[合格證號：SCXK(京)2016-0002]。實驗室溫度18～22℃，濕度40%～70%，晝夜比1:1，保持空氣流通，動物自由飲水、進食。實驗前在實驗室內分籠飼養(yǎng)1周，每籠5只，使其充分適應環(huán)境。

1.2 實驗儀器及材料 ZH-YLS-3E 電子壓痛儀(北京眾實迪創(chuàng)科技公司)，YLS-6B智能熱板儀(濟南益延科技發(fā)展有限公司)，ZS-3板式酶標儀(北京市新風機電技術公司)，DG-300C電泳儀(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)，Multiskan MK3標準規(guī)格酶標儀(Thermo Scientific，美國)。枸櫞酸芬太尼注射液(宜昌人福藥業(yè)有限責任公司，批號1141101)，鹽酸右美托咪定注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號170718BP)，β-actin(AC001-M，美國Santa Cruz公司)，抗α2A-AR抗體(ab45871)、抗iNOS抗體(ab49999)、抗GFAP抗體(ab33922)、抗Iba-1抗體(ab178847，美國Abcam公司)。辣根酶標記的山羊抗兔IgG(SH-0031)和辣根酶標記的兔抗山羊IgG(IH-0071)購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，辣根酶標記的山羊抗小鼠IgG(GB23301，谷歌生物科技有限公司，中國)、辣根酶標記的山羊抗兔IgG(M21002，Abmart公司，中國)、0.5%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X 100，ST795)購自碧云天公司，P物質試劑盒(BPE30328)購自上海浩本生物科技有限公司。

1.3 痛覺過敏模型的建立 參照文獻[14]的方法，改良后使用芬太尼進行造模：先給予皮下注射生理鹽水1ml×1次，最后給予芬太尼60μg/kg×4次，每次間隔15min，依據痛閾檢測結果確定模型建立的效果。

1.4 實驗分組 將大鼠隨機分為5組(n=26)：生理鹽水組(NS組)、芬太尼組(即痛覺模型組，F組)、右美托咪定+芬太尼合劑組(DF組)。DF 組再根據給予的右美托咪定劑量(12.5、25、50μg/kg)分為3個亞組，即右美托咪定+芬太尼合劑1組(DF1組)、右美托咪定+芬太尼合劑2組(DF2組)、右美托咪定+芬太尼合劑3組(DF3組)。各組處理措施如下：NS組大鼠經皮下注射生理鹽水1ml×5次；F組大鼠先經皮下注射生理鹽水1ml×1次，再給予芬太尼60μg/kg×4次；DF各亞組(DF1、DF2、DF3組)：先分別皮下注射特定劑量右美托咪定(12.5、25、50μg/kg)×1次，再給予芬太尼60μg/kg×4次。給藥方法：所有藥物均溶于等體積(1ml)的生理鹽水中，每次給藥間隔時間為15min，由專人負責給藥。

1.5 行為學測試 每天10:00am～12:00am由專人進行行為學測試，給藥前1周對大鼠進行電子壓痛儀筒形固定器和智能熱板儀適應，給藥前30min(定義為d0時點)測定壓尾機械閾值(tail flick threshold，TFT)、熱痛縮爪潛伏期(paw withdrawal latency，PWL)并作為基線值，然后在給藥后2、3、4h及1～5d每天固定的時間點進行行為學測試。

1.5.1 TFT測定 在大鼠尾部距根端10cm處做一標記，置于筒形固定器中，將尾端平放在壓痛平臺上，保持標記點在楔形壓痛模塊下方，待大鼠安靜后開始測量，當大鼠出現逃避反應(如肢體明顯的蜷縮或尾部甩動等)時記錄壓力值(g)，重復測量2次，每次間隔15min，取2次平均值作為大鼠的TFT。為避免組織損傷，將實驗終點的最大值設為600g。

1.5.2 PWL測定 將熱板儀溫度設定為(52.0±0.2)℃，到達設定溫度后拿掉熱板儀上的有機玻璃罩，一手捉鼠，一手拿其后足貼于熱板，同時踏一下腳踏計時開關，當感覺大鼠有明顯的抽動逃避動作時，再踏一下開關進行時間鎖定，重復測試2次，取平均值作為該大鼠痛閾值，兩次測試間隔不應小于15min。為防止大鼠后足燙傷，最大值設置為60s。

1.6 Western blotting檢測α2A-AR和iNOS蛋白的表達參照Célèrier等[14]取材時間點，于給藥后1d從每組隨機取8只大鼠，10%水合氯醛(4ml/kg)腹腔注射麻醉后，剪開背部皮毛，分離脊柱旁的肌肉，根據解剖定位到脊髓的腰膨大區(qū)域離斷脊柱，置于冰生理鹽水中，從椎體側面小心咬開脊椎，取出脊髓腰膨大區(qū)域，置于–80℃液氮保存。樣本稱重后提取蛋白，為避免細微操作影響實驗結果，各組樣本均于同一次實驗取材。進行蛋白電泳、轉膜、5%脫脂奶粉封閉，一抗和二抗孵育，一抗為抗α2A-AR抗體(1:1000)、抗iNOS抗體(1:1000)及內參β-actin(1:5000)，二抗為辣根酶標記的山羊抗兔IgG(1:5000)、辣根酶標記的兔抗山羊IgG(1:4000)和辣根酶標記的山羊抗小鼠IgG(1:4000)，孵育結束后顯影曝光，使用Image J圖像分析軟件分析條帶的灰度值。

1.7 ELISA法檢測SP的表達 給藥后1d每組隨機選取4只大鼠，按Western blotting的取材方法獲取大鼠脊髓腰膨大區(qū)域蛋白提取物，將稀釋后的標準品50μl、待檢樣品40μl和抗SP抗體10μl按照試劑盒說明書分別加入試劑盒標準孔和樣本孔，設立5個復孔，依次加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的鏈霉親和素，混勻后37℃溫育1h，洗板后加入底物避光顯色。采用Multiskan MK3標準規(guī)格酶標儀測量各孔在450nm波長下的光密度(OD值)，使用CurveExpert 1.3軟件計算SP的含量，結果以ng/L表示。

1.8 免疫熒光法檢測GFAP和Iba-1蛋白表達 隨機從每組中選取給藥后1d的8只大鼠，使用10%水合氯醛(4ml/kg)麻醉后心臟灌注，迅速取出脊髓的腰膨大區(qū)域，依次置于4%多聚甲醛、20%蔗糖、30%蔗糖溶液中進行梯度脫水，然后進行冰凍切片(厚度10μm)。將切片放入抗原修復液(100℃，10min)，PBS沖洗后加入打孔液體0.5%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X 100)、10%山羊血清封閉1h，分別加入一抗[抗GFAP抗體(1:500)和抗Iba-1抗體(1:100)]。4℃孵育12h過夜，加入二抗辣根酶標記山羊抗兔IgG(1:5000)，最后使用DAPI染核15min、甘油封片固定，整個過程保持避光。熒光顯微鏡下觀察并拍照，使用Photoshop軟件進行計數，計算出陽性細胞數。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行數據分析。計量資料符合正態(tài)分布時以表示，采用重復測量的方差分析研究時間對痛閾的影響，其他各組間計量資料的比較采用正態(tài)性和方差齊性檢驗后選擇單因素方差分析(One-way ANOVA)或Kruskal-Wallis秩和檢驗，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 行為學檢測結果 由重復測量的方差分析結果可見，組別(FTFT=33.040，PTFT＜0.0001；FPWL=15.842，PPWL＜0.0001)和時間點(FTFT=397.203，PTFT＜0.0001；FPWL=191.931，PPWL＜0.0001)都存在統(tǒng)計學差異，并且存在交叉效應(F=34.283，P＜0.0001；FTFT=16.580，PTFT＜0.0001)。由組內比較結果可見，NS組在各個時間點無統(tǒng)計學差異(PTFT=0.807；PPWL=0.946)。由圖1可見，F組和DF組的TFT和PWL在2～4h時點都高于基線值，而在給藥后1～3d，F組和DF1組的TFT和PWL下降并低于基線值，于第4天恢復至基線水平；DF2組和DF3組在1～5d維持在基線值水平。

圖1 各組各時間點壓尾機械閾值(TFT)和熱痛縮減爪潛伏期(PWL)比較Fig.1 Comparison of the tail flick threshold (TFT) and the paw withdrawal latency (PWL) of each group at each time point

組間比較可見，在d0時各組基礎痛閾值無統(tǒng)計學差異(PTFT=0.871；PPWL=0.746)，TFT在2、3、4h以及1～3d時各組間存在統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，而在4d和5d時點無統(tǒng)計學差異(P4d=0.540；P5d=0.271)；PWL在2、3、4h，以及1～3d時組間存在統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，而在4d和5d時無統(tǒng)計學差異(P4d=0.170；P5d=0.960，表1、2)。

表1 右美托咪定對芬太尼誘導的痛覺過敏大鼠TFT的影響(±s，n=6)Tab.1 Effects of dexmedetomidine on tail flick threshold of fentanyl-induced hyperalgesia in rats (±s, n=6)

表1 右美托咪定對芬太尼誘導的痛覺過敏大鼠TFT的影響(±s，n=6)Tab.1 Effects of dexmedetomidine on tail flick threshold of fentanyl-induced hyperalgesia in rats (±s, n=6)

NS.Saline group; F.Fentanyl group; DF1.Dexmedetomidine and fentanyl first group; DF2.Dexmedetomidine and fentanyl second group; DF3.Dexmedetomidine and fentanyl third group.(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with group NS; (3)P＜0.05, (4)P＜0.01 compared with group F

Group Time point d0 2h 3h 4h 1d 2d 3d 4d 5d NS 281.55±18.80 285.40±13.30 295.00±13.70 285.42±24.62 289.98±16.21 285.37±16.54 286.47±16.95 279.03±13.45278.08±19.13 F 279.29±46.07585.23±36.17(2)441.90±49.39 378.02±69.02 89.52±19.59(1)154.73±31.98(1)218.54±21.50(1)258.07±38.24270.68±31.41 DF1 277.10±19.96 600.00±0.00(2)484.45±58.10 344.83±66.14 111.88±64.49 150.81±76.58 234.81±12.58(1)263.94±31.11276.85±15.91 DF2 289.35±9.18 600.00±0.00(2)600.00±0.00(2)508.80±89.27(1)304.24±58.63(3)304.84±29.71(4)283.32±38.43(3)275.58±21.44295.70±12.78 DF3 280.32±23.22 600.00±0.00(2)600.00±0.00(2)574.95±61.36(2)307.53±40.49(4)273.28±30.24 282.18±20.33(3)284.89±9.50 285.53±15.38

表2 右美托咪定對芬太尼誘導的痛覺過敏大鼠PWL的影響(±s，n=6)Tab.2 Effects of dexmedetomidine on paw withdrawal latency of fentanyl-induced hyperalgesia in rats (±s, n=6)

表2 右美托咪定對芬太尼誘導的痛覺過敏大鼠PWL的影響(±s，n=6)Tab.2 Effects of dexmedetomidine on paw withdrawal latency of fentanyl-induced hyperalgesia in rats (±s, n=6)

NS.Saline group; F.Fentanyl group; DF1.Dexmedetomidine and fentanyl first group; DF2.Dexmedetomidine and fentanyl second group; DF3.Dexmedetomidine and fentanyl third group.(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with group NS; (3)P＜0.05, (4)P＜0.01 compared with group F

Group Time point d0 2h 3h 4h 1d 2d 3d 4d 5d NS 9.81±1.15 9.55±1.61 10.36±1.88 10.05±2.11 10.63±1.21 10.18±1.04 9.86±1.18 9.84±0.84 10.14±0.52 F 10.21±2.44 43.91±6.08 14.93±7.83 9.38±6.08 2.62±0.61(2) 5.47±2.91(1)6.86±1.35(2)8.08±1.33 10.32±1.39 DF1 10.30±1.56 50.39±10.97(1)13.59±6.60 10.01±4.21 5.47±1.42 6.48±0.88 6.41±1.17(2)9.53±0.93 10.05±1.10 DF2 10.06±2.07 52.79±11.16(1)22.40±13.77 17.97±11.25 10.3±1.91(4)9.42±1.49 9.45±2.34(4)9.93±1.87 10.20±1.54 DF3 11.27±2.32 57.12±7.05(2) 42.07±9.97(2)21.85±8.40(3)10.6±2.90(4) 10.43±2.27 9.08±0.96(3)10.07±2.10 10.54±1.14

2.2 α2A-AR和iNOS蛋白表達情況 各組間α2A-AR和iNOS蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義(Fα2A-AR=16.725，Pα2A-AR＜0.001；FiNOS=12.469，PiNOS＜0.001)。LSD-t法進一步兩兩比較顯示，與NS組對比，F組和DF1組α2A-AR蛋白表達明顯下降(P＜0.05)，同時iNOS蛋白表達明顯上調(P＜0.01)；與F組相比，DF2組和DF3組α2A-AR蛋白表達明顯增加(P＜0.01)，同時iNOS蛋白表達明顯下降(P＜0.01，圖2)。

圖2 右美托咪啶給藥后1d各組α2A-AR和iNOS蛋白表達情況Fig.2 The expressions of α2A-AR and iNOS on the first day after administration of dexmedetomidine in the 5 groups

2.3 SP的表達情況 各組間SP表達水平差異有統(tǒng)計學意義(F=21.365，P＜0.001)。LSD-t檢驗結果顯示，與NS組比較，F組的SP表達明顯增加(P＜0.05)，而DF組SP表達均明顯下降(P＜0.01)；與F組比較，DF組SP表達明顯下降(P＜0.01，圖3)。

圖3 右美托咪啶給藥后1d各組SP表達情況Fig.3 The expressions of substance P on the first day after administration of dexmedetomidine in the 5 groups

2.4 GFAP和Iba-1的表達情況 在給藥后1d，與NS組比較，F組星形膠質細胞標記物GFAP的表達明顯增加(P＜0.01，圖5)，而與F組比較，DF組的GFAP表達明顯下降(P＜0.01，圖4)。小膠質細胞標記物Iba-1的變化趨勢與GFAP相同(圖5)。

圖4 右美托咪啶給藥后1d大鼠脊髓背角GFAP的免疫熒光表達情況Fig.4 The immunofluorescence intensity of GFAP in the spinal dorsal horn of the rats on the first day after administration

圖5 右美托咪定給藥后1d大鼠脊髓背角Iba-1的免疫熒光表達情況Fig.5 The immunof luorescence intensity of Iba-1in the spinal dorsal horn of the rats on the first day after administration of dexmedetomidine

3 討 論

圍術期最常見的OIH是由于麻醉過程中患者長時間暴露于瑞芬太尼引起的，其發(fā)生機制可能與應用時間長和突然戒斷密切相關。但是，由于瑞芬太尼具有嚴重的呼吸抑制性，限制了其在動物模型中的應用，因此本研究根據Célèrier等[14]和Chang等[15]的研究，選擇芬太尼用于大鼠痛覺過敏模型的建立。本研究發(fā)現，與應用生理鹽水(NS組)的大鼠比較，芬太尼(F組)對大鼠的鎮(zhèn)痛效應在給藥后2～4h出現高峰，而給藥后1～3d出現的低峰區(qū)域則顯示芬太尼誘發(fā)了痛覺過敏效應；而本研究發(fā)現右美托咪定與芬太尼合用的兩組，即DF2和DF3組在2～4h時間段的鎮(zhèn)痛效果要優(yōu)于芬太尼單用組，本研究結論也驗證了Chan等[16]的結論，即右美托咪定可以增強阿片類藥物的鎮(zhèn)痛效果。而且，在給藥后1～5d DF2和DF3兩組的痛閾水平與NS組類似，并未發(fā)生痛覺過敏，可見右美托咪定在一定劑量下可以防治芬太尼誘發(fā)的痛覺過敏。

痛覺調控的機制極其復雜，右美托咪定防治芬太尼誘發(fā)的痛覺過敏機制可能是通過發(fā)揮其鎮(zhèn)痛作用從而抵消痛覺過敏。本研究通過芬太尼誘導建立大鼠痛覺過敏模型，設置不同的給藥條件，發(fā)現在芬太尼用藥前給予一定劑量的右美托咪定可使α2A-AR蛋白表達水平呈劑量依賴性地增加，同時下調iNOS、SP、星形膠質細胞和小膠質細胞標志物的表達。據報道，α2-AR參與痛覺敏化的調控[17-18]，而右美托咪定可對包括α2A-AR亞型在內的α2-AR發(fā)揮激動作用。星形膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)的神經膠質細胞之一，廣泛參與神經系統(tǒng)的分化和免疫反應調節(jié)[19]。作為中樞神經系統(tǒng)的常駐巨噬細胞，小膠質細胞在神經炎癥中發(fā)揮著重要作用[20]。星形膠質細胞和小膠質細胞過度激活后可產生過量的炎性介質iNOS，而SP作為一種傷害性神經遞質，在脊髓淺層背角的含量隨著機械誘發(fā)疼痛的減輕而下降[21]，提示右美托咪定防治芬太尼誘發(fā)的痛覺過敏機制可能與α2A-AR激活，以及抑制星形膠質細胞和小膠質細胞的活性，減少iNOS、SP的表達有關。

綜上所述，本研究發(fā)現右美托咪定可通過激活α2A-AR抑制星形膠質細胞和小膠質細胞的活化，減少炎癥介質釋放，使iNOS表達下降，從而使P物質表達下降，對痛覺過敏起到了預防作用。本研究為臨床防治OIH提供了新的思路，但右美托咪定防治OIH機制比較復雜，仍有待更多的研究予以進一步闡釋。