劉志強，柳 靜

1 HH信號通路的組成和活化機制

在哺乳動物中，HH信號通路的核心元件是包括3個配體 sonic hedgehog（SHH）、desert hedgehog（DHH）和Indian hedgehog（IHH）、1個12次跨膜的膜受體Patched1（PTCH1）、1個像G蛋白耦聯(lián)受體的7次跨膜蛋白smoothened（SMO）和3個轉錄因子glioma-associated oncogene homolog 1（GLI1）、glioma-associated oncogene homolog 2（GLI2）和 glioma-associated oncogene homolog 3（GLI3）[1]。

纖毛是細胞膜上的突出結構，由微管支撐，HH信號通路的主要元件皆與它密切相關。它為這些信號通路中的分子提供了特定的區(qū)域，對其分布和功能極其關鍵。纖毛可能還有其他的作用，其中信號通路各分子的濃度可以調(diào)控對信號的反應，而纖毛細胞器本身也具有特殊的固有調(diào)節(jié)。例如，最近有研究表明，纖毛中有一個脂質(zhì)膜成分對纖毛的功能和HH信號通路十分重要[2]。

當沒有HH配體時，PTCH1定位在纖毛上，對纖毛上積累的SMO起抑制作用，這是哺乳動物激活信號通路不可避免的一步。PTCH1在纖毛上發(fā)揮著關鍵的作用，一個強有力的證據(jù)就是PTCH1可以抑制SMO的活性，其對SMO的抑制作用是通過纖毛上PTCH胞內(nèi)不同長度截短的尾巴調(diào)整其強度[3]。當與HH配體結合時，PTCH1離開纖毛，從而解除了對SMO的抑制作用，允許SMO易位到纖毛中。對于纖毛上PTCH1的離開和SMO的進入之間的關系以及信號通路的激活至今仍是一個謎。在進入纖毛之前，SMO與Discs Large Homolog 5（DLG5）在基底部結合，這一步對隨后信號通路的激活十分重要[4]。在纖毛中，SMO與Ellis-van Creveld syndrome protein（EVC）和EVC2形成復合體傳導HH信號[5]。SMO的激活觸發(fā)胞內(nèi)的信號級聯(lián)傳導，從而促進了轉錄因子GLI在纖毛的轉運及加工處理，調(diào)控其轉錄活性[6]。

哺乳動物的3個GLI蛋白含有共同的DNA結合結構域，包括5個串聯(lián)的C2H2鋅指結構和一個C端激活結構域，只有GLI2和GLI3包含N端阻遏物結構域[7]。GLI1編碼一個前饋通路的激活因子用于對通路激活作出響應，Gli1的轉錄完全取決于HH信號通路的激活[8]。GLI2和GLI3可形成全長的激活因子或截短的抑制形式[9]。GLI的直接功能是決定細胞的命運，是組織形態(tài)的控制、細胞增殖和細胞存活調(diào)節(jié)器，HH信號通路的不同元件也在正/負反饋調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[8]。

大量的研究發(fā)現(xiàn)HH信號通路中與GLI調(diào)控相關的蛋白質(zhì)。哺乳動物GLI蛋白的兩個核心調(diào)控蛋白是 suppressor of fused（SUFU）和 kin-esin family member 7（KIF7）。在細胞質(zhì)中，SUFU通過對三個GLI蛋白的阻滯從而對哺乳動物HH信號通路起負調(diào)控作用，在核內(nèi)SUFU也能與GLI2反應抑制GLI2的活性[10]。KIF7是一種驅(qū)動蛋白，在纖毛的順行性傳輸（從基部到頂端）中起作用[11]。在從基部到頂端過程中有一系列激酶調(diào)控GLI的磷酸化，包括protein kinase A（PKA）、casein kinase I（CK1）、glycogen synthase kinase 3β（GSK3β）12。GLI2和 GLI3被PKA、CK1、GSK3β磷酸化，然后被蛋白酶體加工處理形成各自的阻遏形式GLI2R和GLI3R[12]。在這種情況下，定位于纖毛基部的G蛋白偶聯(lián)受體GPR161上調(diào)cAMP，激活了PKA活性[13]。一旦信號活化，KIF移動到纖毛的頂部促進GLI2和GLI3的激活，抵制SUFU的活性，cAMP的水平因GPR161離開纖毛和PDE4的降解作用而下調(diào)，PKA的活性也因其下調(diào)而受限制[14]。綜上所述，從SUFU解離出來的GLI2和GLI3形成了激活的GLI2和GLI3（GLI2A和GLI3A），轉移到核內(nèi)并激活它們的靶基因。在經(jīng)典HH信號通路中，大多數(shù)GLI依賴的HH靶基因的激活都是受GLI2A調(diào)控的[15]。

2 Hedgehog信號通路在造血系統(tǒng)中的作用

在胚胎造血中，Hh信號通路隨時間和環(huán)境而改變。小鼠研究表明，IHH在早期的血生成和血管生成的激活過程中發(fā)揮關鍵作用。IHH和SMO缺失都與“血島”分化和功能血管重建的抑制有關[16]。相反，在替代實驗條件下，IHH缺乏沒有損害早期的紅細胞生成、造血干細胞(haematopoietic stem cell，HSC)或祖細胞形成[17]。反而晚期紅細胞生成有缺陷，常常導致致命性妊娠中期貧血。在哺乳動物胚胎中出現(xiàn)多功能HSCs的第一個確定位點被稱為主動脈-性腺-中腎區(qū)(aorta-gonad-mesonephros，AGM)區(qū)域。Gering和Patient提出，至少在斑馬魚胚胎中，Hh通路抑制環(huán)巴胺在早期造血過程中，使SMO穩(wěn)定在非活性狀態(tài)下，導致HSC血生成缺陷[18]。此外，Zhao等在SMO敲除小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，HSC在二次移植中出現(xiàn)長期的功能性缺陷，表明SMO在HSC功能中起著重要的作用[19]。在小鼠造血細胞中，條件性缺失PTCH1未能誘導Hh通路的功能上調(diào)，且無表型效應[20]。相反，在骨髓微環(huán)境中缺失PTCH1，增加了c-kit+/Sca-1+陰性細胞，髓樣祖細胞的動員，以及T淋巴細胞和B淋巴細胞的凋亡。因此，PTCH1的缺失導致了不同細胞外機制的造血作用，細胞循環(huán)增加，而不是直接激活造血細胞中的Hh信號通路。這些研究強調(diào)了Hh通路抑制藥物對造血直接和間接作用的重要性。

為了探討GLI家族成員在正常造血過程中的重要性，研究通路遠端的SMO和PTCH1，Merchant等發(fā)現(xiàn)在Gli1敲除的小鼠模型中的HSC和祖細胞分布位置是不同的。與野生型小鼠相比，Gli1敲除小鼠增加了長期的HSC，缺陷的HSC和祖細胞增殖，降低了骨髓分化。此外，Gli1敲除的HSCs的細胞周期蛋白D1表達減少，極有可能導致增殖減弱。總體而言，Hh信號在正常的造血過程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用[21]。然而，與這些結果形成鮮明對比的是，其他實驗系統(tǒng)使用增益和功能損失條件的SMO基因模型表明，Hh通路活性實際上對HSC的維持和功能是可有可無的。Dierks等指出，當胎鼠肝臟的SMO/HSCs(妊娠14～5 d)移植到C57BL/6小鼠時，未出現(xiàn)明顯的再生能力缺陷。然而，明顯的是CD8+T細胞幾乎完全喪失，強調(diào)了Hh信號通道對淋巴細胞發(fā)育的重要性[22]。其他的工作也證明，條件性SMO缺失或過度激活對成人HSC的功能和自我更新無顯著影響。在SMO缺陷小鼠中，SMO缺失對HSCs的相對頻率或絕對數(shù)量均無影響。如果是這樣的話，至少在成人造血穩(wěn)定時期時，這可能會增加惡性生理造血的治療空窗期。這明顯地對比了Zhao等人所描述的關于SMO缺陷小鼠的研究結果，盡管使用了不同的實驗方法。在Zhao的實驗方法中，雖然SMO缺陷小鼠的HSCs和分化細胞的頻率與對照組比較無變化，但在原發(fā)性和繼發(fā)性移植的HSC長期功能上存在明顯的缺陷[19]。

3 HH信號通路與多發(fā)性骨髓瘤藥

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種漿細胞來源的惡性血液系統(tǒng)腫瘤，起源于骨髓中的漿細胞，屬于一種B淋巴細胞淋巴瘤。目前WHO將其歸為B細胞淋巴瘤的一種，其特征為骨髓漿細胞異常增生伴有單克隆免疫球蛋白或輕鏈（M蛋白）過度生成[23]。多發(fā)性骨髓瘤常伴有多發(fā)性溶骨性損害、高鈣血癥、貧血、腎臟損害、細菌性感染等并發(fā)癥。西方國家發(fā)病率估計為2～3/10萬，我國的發(fā)病率為～1.5/10萬，男女比例為1.6︰1，大多患者年齡＞40歲[24]。目前，MM的治療主要靠藥物化療，但是常規(guī)化療效果差，預后不良，而腫瘤多藥耐藥性（multi-drug resistance，MDR）則是MM化療失敗的關鍵因素。人惡性腫瘤對化療的耐藥性可分為先天性耐藥和獲得性耐藥。大量研究表明，HH信號通路在腫瘤耐藥性形成過程中發(fā)揮重要作用。HH的活化根據(jù)其機制不同，分為經(jīng)典型活化通路和非經(jīng)典型活化通路。其中經(jīng)典型活化指的是通過配體，即SHH、IHH、或者DHH與受體PTHC結合之后，激活GLI轉錄因子而發(fā)生的HH信號通路活化；而非經(jīng)典型活化指的是不依賴于配體的活化方式，通常包括受體的突變、細胞漿或者細胞核內(nèi)其他因子對GLI1、GLI2等轉錄因子的持續(xù)活化性修飾而導致的異?；罨痆25]。無論是配體依賴型還是非依賴型，腫瘤發(fā)生過程的一個關鍵驅(qū)動因素是因其過度活化。Munshi實驗室的研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典和非經(jīng)典的Hedgehog信號通路的激活在MM腫瘤發(fā)生中都發(fā)揮了重要的作用[26]。Lennon實驗室對MM病人樣本進行GLI3、SHH、PTCH1和p53基因突變的測序發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)9%的MM患者體內(nèi)存在GLIPR1/GLIPR1L1/GLIPR1L2三個缺失突變的位點，因為GLI3是一種抑制性的轉錄因子，因此GLI3的突變造成了HH信號通路的過度活化，這也是非經(jīng)典HH信號通路活化的一種方式[27]。

我們實驗室之前的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典型和非經(jīng)典型Hedgehog信號通路的活化，都能誘導MM細胞產(chǎn)生耐藥性。在多發(fā)性骨髓瘤病人的骨髓中，骨髓瘤細胞能自分泌產(chǎn)生SHH，通過與PTCH1受體結合激活HH通路，促進下游抗凋亡基因BCL2的表達，抑制化療藥物馬法蘭、硼替佐米等誘導的細胞凋亡，從而產(chǎn)生腫瘤耐藥[28]。Derick等的研究也發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細胞分泌的SHH因子，也可以通過旁分泌的方式，激活HH通路，促進多發(fā)性骨髓瘤細胞的增值和化療藥物引起的耐藥性[29]。另外，我們還發(fā)現(xiàn)，發(fā)性骨髓瘤細胞內(nèi)異?；罨腗APK-ERK通路，能夠通過MEK1抑制GSK3b的水平，從而抑制對GLI2的泛素化降解，造成GLI2過度積累從而造成HH通路的過度活化，促進其下游的BCL2的轉錄調(diào)控表達，從而促進MM細胞產(chǎn)生耐藥性[30]。

隨著對MM耐藥性產(chǎn)生的研究進展，發(fā)現(xiàn)一些microRNA是通過調(diào)控Hedgehog通路來實現(xiàn)的。Tang等人的研究發(fā)現(xiàn)，miR-324-5p在多發(fā)性骨髓瘤病人體內(nèi)是低表達的，但是SMO和GLI1都是高表達的，尤其是17p染色體缺失突變的病人，這是因為miR-324基因跟HH的基因都定位于同一條染色體上。功能學的研究也發(fā)現(xiàn)，miR-324-5p可以抑制MM細胞的增值、抗凋亡和腫瘤細胞的干性[31]。Xu等的研究發(fā)現(xiàn)，miR-1271在MM的初發(fā)病人和MM細胞系中都是低表達的，而且過表達miR-1271將抑制MM細胞的增值，并且能促進凋亡。機制研究發(fā)現(xiàn)，miR-1271是通過直接負調(diào)控SMO受體實現(xiàn)的[32]。這些研究的結果，為未來開發(fā)逆轉MM耐藥性提供了靶點的參考。

Hedgehog信號通路也可能是通過促進MM腫瘤干細胞而達到促進腫瘤產(chǎn)生耐藥性的。Peacock CD等的研究表明，在MM細胞，有一群比較少的側群細胞，其表面標志物為CD19+CD138-的為分化細胞，具有特別高表達的HH通路活性[33]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，在復發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤的病人MM細胞中，RARα2受體比初發(fā)病人顯著增高，而且跟預后呈現(xiàn)負相關。實際上，高表達的RARα2是在MM腫瘤干細胞內(nèi)，其主要的作用有以下幾點：①促進腫瘤的耐藥性；②增強其克隆形成能力；③激活Wnt和Hedgehog信號通路；④增加側群細胞的數(shù)量和醛脫氫酶的活力；⑤上調(diào)胚胎干細胞的基因表達[34]。由此可見，無論是HH自身直接活化，還是通過其他通路誘發(fā)的非經(jīng)典通路活化，都可以通過維持MM腫瘤干細胞。因為腫瘤干細胞也是腫瘤產(chǎn)生耐藥性的一種重要機制，因此Hedgehog信號通路可能是通過維持MM細胞的中路干細胞干性，從而產(chǎn)生耐藥性。

4 小結與展望

HH抑制劑已成為治療多種腫瘤的有效手段，但HH通路還沒有被人們完全了解。結合目前的研究進展，揭示在體內(nèi)更深層次的調(diào)控機制有利于我們針對HH通路依賴型腫瘤，包括多發(fā)性骨髓瘤，研發(fā)更有成效的腫瘤治療策略。在治療上，HH通路是一個重要的腫瘤治療和再生醫(yī)學靶點。雖然在成體階段靜息狀態(tài)的HH通路被激活對各種器官再生發(fā)揮重要作用，但并沒有利用HH通路這些有利方面的臨床報道。而且，一開始人們把研究集中在HH通路在促腫瘤發(fā)生的破壞性作用上，HH最突出的作用就是刺激和促進癌癥發(fā)生，這也使得人們在進行再生治療時應更加謹慎。

對于提高對HH通路依賴型腫瘤的治療策略還有很大的探索空間，目前，vismodegib和sonidegib作為SMO抑制劑，都應用到對SMO的臨床治療，也可以對晚期和轉移性BCC進行治療。通過對MM患者的研究，尋找鑒定區(qū)分患者響應的方法能夠幫助更好的設計和解釋臨床試驗。

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