(青島大學(xué)國家生理學(xué)重點(培育)學(xué)科，山東 青島 266071)

帕金森病(PD)是一種發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病(AD)的第2大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。許多研究表明，遺傳、環(huán)境、老齡化和氧化應(yīng)激等因素均參與了PD的發(fā)病的過程[1-2]。目前，臨床上用于治療PD的藥物只能在一定程度上改善疾病的相關(guān)癥狀，而不能阻止PD病情的發(fā)展[3-5]。因此，闡明PD的發(fā)病原因及可能機制成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究亟需解決的難題。

FAM3基因家族(FAM3)是2002年新發(fā)現(xiàn)的一個細(xì)胞因子樣基因家族，目前已知包括FAM3A、FAM3B、FAM3C和FAM3D 4個成員[5]。FAM3基因家族成員的蛋白序列由224～235個氨基酸殘基組成，具有高度的同源性，而與其他已知的蛋白均沒有發(fā)現(xiàn)同源性[6-7]。目前的研究已初步揭示FAM3基因家族成員有可能在包括糖尿病、腫瘤及神經(jīng)退行性疾病等在內(nèi)的多種重大疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[8-10]。FAM3C是FAM3基因家族的第3個成員，研究發(fā)現(xiàn)FAM3C在人與小鼠的全身組織中均有表達(dá)[11]。目前越來越多的研究表明，F(xiàn)AM3C是葡萄糖和脂質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)劑[12]，而且FAM3C的異常表達(dá)參與了多種腫瘤的形成及轉(zhuǎn)移過程[13-14]。HASEGAWA等[15]研究顯示，AD的發(fā)生和大腦中淀粉樣斑塊的形成密切相關(guān)，F(xiàn)AM3C通過破壞淀粉樣β前體的穩(wěn)定來改善阿爾茨海默病。然而，F(xiàn)AM3C在PD發(fā)病中的作用尚不明確。本研究選用攜帶人突變型α-突觸核蛋白A53T純合子(α-SynA53T+/+)小鼠，通過檢測不同月齡的α-SynA53T+/+小鼠黑質(zhì)(SN)區(qū)FAM3C蛋白的表達(dá)水平，探究FAM3C在PD發(fā)生、發(fā)展中的作用，為闡明PD發(fā)生和發(fā)展的分子機制提供實驗基礎(chǔ)?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康α-SynA53T+/+小鼠購于南京大學(xué)模式動物研究所，按SPF級別飼養(yǎng)，置于室溫(22±2)℃下，12-12 h晝夜循環(huán)光照下生活，自由飲水取食。鑒定基因型后，選取3、6月齡雄性α-SynA53T+/+小鼠和同窩野生型(WT)小鼠各4只。所有關(guān)于實驗動物的操作均符合青島大學(xué)實驗動物操作規(guī)則中的要求。

1.2 儀器與試劑

大鼠源FAM3C抗體購買于美國R&D SYSTEMS公司，小鼠源Alpha-Synuclein抗體購買于英國Abcam公司，HRP標(biāo)記山羊抗大鼠IgG購買于MDBio.Inc公司，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購買于Absin公司，RIPA裂解液、分離膠緩沖液和濃縮膠緩沖液購于康為公司，ECL發(fā)光試劑盒購買于美國Millipore公司。

1.3 實驗儀器

電泳槽Mini-VE、電轉(zhuǎn)儀(濕轉(zhuǎn))Trans-Blot和電泳儀Power-Pac200購買于美國BIO-RAD公司。

1.4 Western Blot方法鑒定小鼠基因型及檢測小鼠SN區(qū)FAM3C蛋白表達(dá)水平

以水合氯醛深度麻醉小鼠，迅速斷頭，完整取出包括中腦SN區(qū)的腦組織，置于冰盒內(nèi)，迅速準(zhǔn)確取出SN部分，放入預(yù)冷的EP管中，準(zhǔn)確稱質(zhì)量后，在冰上用加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液充分研磨、裂解30 min以后，4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，取上清液于新的EP管中，應(yīng)用酶標(biāo)儀以BCA法測定波長562 nm處的吸光度值，進(jìn)行蛋白濃度測定。按每孔25 μg蛋白上樣，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子質(zhì)量的蛋白分開，然后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，于室溫下以100 g/L的脫脂奶粉封閉2 h；分別加入大鼠源FAM3C一抗(1∶300)和小鼠源Alpha-Synuclein 一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，在PBST中洗3次后，分別與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG(1∶5 000)和山羊抗小鼠IgG(1∶10 000)在室溫下孵育1 h，在PBST中洗滌3次，ECL發(fā)光液顯影，UVP凝膠成像系統(tǒng)成像后用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 α-SynA53T+/+小鼠的鑒定

Western Blot方法檢測結(jié)果顯示，3月齡α-SynA53T+/+小鼠SN區(qū)Human-α-Syn蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.884，P<0.05)。6月齡α-SynA53T+/+小鼠SN區(qū)Human-α-Syn蛋白的表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.779，P<0.05)。見圖1。

2.2 不同月齡α-SynA53T+/+小鼠SN區(qū)FAM3C蛋白表達(dá)變化

Western Blot方法檢測結(jié)果顯示，3月齡α-SynA53T+/+小鼠SN區(qū)FAM3C蛋白水平與WT小鼠相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.245,P>0.05)；而6月齡α-SynA53T+/+小鼠SN區(qū)FAM3C蛋白表達(dá)水平與WT小鼠相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.865,P<0.05)。見圖2。

3 討 論

PD的主要病理特征是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的退行性變性死亡，黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元漸進(jìn)性死亡與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)胞因子參與了PD的發(fā)生及發(fā)展過程，PD病人腦脊液中的腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素1β和白細(xì)胞介素6的含量出現(xiàn)了上升[16-18]。自FAM3家族被發(fā)現(xiàn)以來，國內(nèi)外研究者對FAM3基因家族成員的生物學(xué)功能展開了深入的研究，目前的研究已經(jīng)初步揭示FAM 3基因家族在代謝、腫瘤以及蛋白質(zhì)相互作用等方面具有重要的生理作用[6,7,10,19]。FAM3A是FAM3細(xì)胞因子樣基因家族的第1個成員，體外研究表明，F(xiàn)AM3A主要定位在培養(yǎng)肝細(xì)胞的線粒體之中，具有促進(jìn)ATP生成以及分泌的作用[20-21]。FAM3B是FAM3基因家族的第2個成員，主要表達(dá)于胰腺，具有與炎癥因子白細(xì)胞介素6相似的致細(xì)胞凋亡的作用[22-23]，在胰島素抵抗和2型糖尿病發(fā)展過程中起重要作用，其可能成為2型糖尿病的新干預(yù)靶點[24-25]。FAM3D被發(fā)現(xiàn)可能介入了機體能量代謝異常、結(jié)腸癌及嗜睡等的發(fā)生發(fā)展過程[18,24,26-27]。FAM3C是FAM3基因家族的第3個成員，已被發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育和視網(wǎng)膜功能調(diào)控、上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及胰腺癌發(fā)生過程中起著重要作用，在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了高水平的FAM3C蛋白表達(dá)[15,28-30]。在唾液腺、胰腺、結(jié)腸、十二指腸和乳腺中的分泌性上皮細(xì)胞中也有FAM3C的表達(dá)[13]。近年來FAM3C的功能和表達(dá)也在哺乳動物大腦中進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示FAM3C水平降低與AD的發(fā)病有關(guān)，腦內(nèi)FAM3C的表達(dá)水平在出生后達(dá)到峰值，隨著年齡的增長而下降，與年齡匹配的正常腦相比，AD腦中FAM3C免疫反應(yīng)神經(jīng)元的陽性數(shù)量減少[15,30]。

A:3月齡，B:6月齡。

A：3月齡，B：6月齡。

本實驗研究顯示，PD模型小鼠在6月齡時SN區(qū)FAM3C蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)增高，提示FAM3C異常表達(dá)參與了PD的發(fā)生及發(fā)展過程，為進(jìn)一步闡述PD的發(fā)病機制提供了實驗依據(jù)。

綜上所述，在PD的發(fā)病過程中出現(xiàn)了SN區(qū)FAM3C的異常表達(dá)，但其對PD發(fā)病機制的作用還需要進(jìn)一步的研究探討。