溫 蕾，陳肇源，陳桂霞，袁鏡樂(lè)

（1.東莞市厚街鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，廣東 東莞 523960；2.東莞市萬(wàn)江農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，廣東 東莞 523050）

隨著獸醫(yī)臨床診斷技術(shù)快速發(fā)展，動(dòng)物傳染病的診斷經(jīng)常采用準(zhǔn)確快速的PCR、熒光PCR等分子生物學(xué)方法、血清學(xué)檢測(cè)方法等；但是，若想更直觀詳細(xì)地了解病理、確定病情發(fā)展進(jìn)程，組織切片技術(shù)往往是必不可少的。根據(jù)不同的制作工藝，組織切片技術(shù)可分為石蠟切片和冰凍切；其中石蠟切片具有直觀性、可保存時(shí)間長(zhǎng)、成本低廉、運(yùn)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，在疾病診斷、病理學(xué)研究等方面的運(yùn)用尤其成熟，是獸醫(yī)診斷中是最權(quán)威的診斷方法之一。因此，本文將對(duì)石蠟切片的制作及其免疫熒光染色技術(shù)作一簡(jiǎn)要概述。

1 制作石蠟切片

石蠟切片，將獲得的新鮮動(dòng)物組織迅速經(jīng)二甲苯固定，經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片等步驟以獲得5～10μm的組織薄片，后經(jīng)蘇木精染色、HE染色、免疫組化和免疫熒光染色等方法，獲得相應(yīng)數(shù)據(jù)。

1.1 固 定 根據(jù)組織的特點(diǎn)將其縱切成小塊，使被檢測(cè)部位包含在組織塊之中。4%多聚甲醛固定，放置水平搖床慢搖24h。

1.2 脫 水 自來(lái)水洗滌3次，0.5h；30%、50%、75%、85%及95%乙醇溶液逐級(jí)脫水0.5h；最后無(wú)水乙醇脫水3次，共3h。

1.3 透 明 二甲苯與無(wú)水乙醇1：1，15min；二甲苯，10～15min；二甲苯 10～15min。

1.4 浸 蠟 已經(jīng)透明的組織塊浸入石蠟，1h；純石蠟，2h～4h。

1.5 包 埋 （1）將組織塊切面朝下，平放入手工小紙盒，加滿石蠟進(jìn)行包埋；（2）再將紙盒放在冰水中冷卻以促進(jìn)蠟塊凝固；（3）包埋好的組織塊室溫或4℃保存半年以上。

1.6 其他步驟 冷卻好的蠟塊最后通過(guò)切片、展片、撈片、烤片的步驟得到5～10μm厚度的切片標(biāo)本放入37℃烘箱內(nèi)保存，用于后期染色和免疫組化等檢測(cè)。

2 切片的免疫組化染色

免疫組化，基本原理是抗原抗體反應(yīng)，通過(guò)標(biāo)記的特異性抗體（或抗原）對(duì)組織內(nèi)抗原（或抗體）的分布進(jìn)行原位的檢測(cè)技術(shù)；其優(yōu)點(diǎn)在于通過(guò)熒光抗體或DAB染色可清晰地顯示出所檢測(cè)抗原（抗體）的陽(yáng)性區(qū)域，特異性強(qiáng)、靈敏度高，與ELISA等檢測(cè)方法相比成本低廉；病理切片常用于疾病的確診。

2.1 具體步驟

脫蠟：二甲苯 5～8min×3 次；二甲苯無(wú)水乙醇溶液（1：1），3min；無(wú)水乙醇3min×2次；95%、85%、75%、50%、30%乙醇溶液逐級(jí)浸泡3min；蒸餾水，2min。免疫組化染色：按照免疫組化過(guò)程進(jìn)行抗原修復(fù)、阻斷、孵育一抗、清洗、孵育二抗（帶熒光標(biāo)記或化學(xué)DAB試劑）1～2h，清洗、封片、鏡檢和拍照。

2.2 數(shù)據(jù)分析 利用光密度分析軟件對(duì)病理圖片進(jìn)行分析得出數(shù)據(jù)，并通過(guò)Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理作圖及統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，t檢驗(yàn)分析組間差異，p＜0.05具有顯著性的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 技術(shù)討論

3.1 石蠟切片制作常見問(wèn)題和關(guān)鍵因素

（1）石蠟切片對(duì)組織取材的專業(yè)性要求高，不同組織其韌性不同，組織塊切割大小方位不一。不新鮮的組織因細(xì)胞破裂或結(jié)構(gòu)不清，都會(huì)導(dǎo)致切片制作失敗。（2）固定、脫水和透明步驟要針對(duì)不同組織制定不同方案，操作者對(duì)石蠟切片質(zhì)量影響很大，不熟練的操作通常會(huì)造成裂片、斷片、組織結(jié)構(gòu)不完整等問(wèn)題，這通常發(fā)生在切片和展片、撈片過(guò)程中。（3）切片染色期間也要特別注意抗體配比和染色時(shí)間的控制，背景太深、著色太淺將影響切片病理觀察及半定量數(shù)據(jù)分析。（4）每張切片制作完成都是一個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，及時(shí)記錄有助于實(shí)驗(yàn)改進(jìn)，關(guān)鍵因素有：組織新鮮與否、固定是否及時(shí)，脫水徹底與否，透明是否合適，脫蠟是否徹底。（5）制作高質(zhì)量的石蠟切片要求操作者有嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度和良好的主觀能動(dòng)性，把握步驟、時(shí)間、溫度、試劑濃度等基本要素，提前實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，合理安排實(shí)驗(yàn)進(jìn)度。（6）環(huán)境溫度、濕度、季節(jié)等也會(huì)影響切片質(zhì)量。

3.2 石蠟切片染色效果比較

免疫組化的DAB染色的應(yīng)用極廣，靈敏度最高，染色時(shí)間較短，切片染色效果保存時(shí)間最長(zhǎng)，常用于單一變量的分析上；相對(duì)DAB染色，石蠟切片的熒光染色成本略高，能更加形象地展現(xiàn)細(xì)胞的病理區(qū)域，而且可以同時(shí)呈現(xiàn)細(xì)胞的兩種或兩種以上抗體的定位，在細(xì)胞骨架成分在細(xì)胞上的分布、磷酸化程度和自噬活動(dòng)等方面的研究應(yīng)用上有明顯優(yōu)勢(shì)，較DAB染色假陽(yáng)性少。