冷 艷，孫憲迅，王 璐，徐 媛，陳禪友

（江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院；湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430056）

0 引言

植物凝集素（Lectin）是植物界中存在的非免疫來(lái)源蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)或一個(gè)以上能夠可逆結(jié)合到特異單糖或多糖上的非催化結(jié)構(gòu)域［1］。最早發(fā)現(xiàn)植物凝集素的是Stillmark等人，他們?cè)?888年從萬(wàn)麻籽的提取物中發(fā)現(xiàn)一種物質(zhì)，該物質(zhì)能使動(dòng)物紅細(xì)胞發(fā)生凝集現(xiàn)象。隨后人們又陸續(xù)從其他植物中發(fā)現(xiàn)了類似的物質(zhì)，并證明了該物質(zhì)在自然界中是普遍存在的。正是由于此類物質(zhì)能使動(dòng)物紅細(xì)胞發(fā)生凝集，它們也被統(tǒng)稱為血細(xì)胞凝集素［2-6］。目前已發(fā)現(xiàn)的凝集素有1 000多種，且這些凝集素主要存在于植物的種子和組織中。由于植物凝集素具有生物活性，使得其在食品、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域受到研究人員的廣泛關(guān)注。近年來(lái)對(duì)于植物凝集素檢測(cè)方法的研究也取得了一定的進(jìn)展。

1 植物凝集素的分類

由于不同種類和來(lái)源的植物凝集素在分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、生物活性、糖基結(jié)合特異性等方面存在明顯差異，因此可根據(jù)這些不同的特性，將植物凝集素進(jìn)行具體的分類。如根據(jù)植物凝集素特異性結(jié)合不同種類的糖基，可分為：N-乙酰氨基半乳糖凝集素、D-甘露糖或D-葡萄糖凝集素、N-乙酰氨基葡萄糖凝集素、D-半乳糖凝集素、L-巖藻糖凝集素及唾液酸凝集素；根據(jù)植物凝集素分子結(jié)構(gòu)的不同，可分為全凝集素（hololectin）、部分凝集素（merolectin）、嵌合凝集素（chemerolectin）和超凝集素（superlectin）［7-9］。

2 植物凝集素的生物活性

2.1 植物天然的防御蛋白

植物凝集素在植物防御體系中起著非常重要的作用，這主要是由于植物凝集素具有和單糖或多糖發(fā)生特異性可逆結(jié)合的能力，尤其是對(duì)在植物中不常見或根本不存在的寡聚糖具有很高的親和力［10］。例如，豆科植物凝集素中的幾種可以與細(xì)菌肽聚糖的組成成分N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰胞壁酸等發(fā)生作用，從而起到防治細(xì)菌侵害的作用［11］。幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素可以與真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)或無(wú)脊椎動(dòng)物外骨骼中的寡糖結(jié)合，從而防治真菌或害蟲對(duì)植物的侵害。很多單子葉植物中的甘露糖凝集素對(duì)動(dòng)物（包括人）的反轉(zhuǎn)錄病毒具有抑制作用（Peumans）。植物凝集素的這一生物學(xué)特性在植物的病蟲害防治研究領(lǐng)域越來(lái)越被研究人員關(guān)注。

2.2 植物凝集素的抗?fàn)I養(yǎng)作用

植物凝集素是一類抗?fàn)I養(yǎng)因子，具有抗?fàn)I養(yǎng)作用，主要表現(xiàn)為：①阻礙動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，如大豆凝集素可以導(dǎo)致非血紅素鐵和脂肪的吸收障礙，增加內(nèi)源氮的排出，從而降低了氮在動(dòng)物體內(nèi)的留存率［7，12］；②對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)的抑制作用，且該抑制作用隨動(dòng)物種類、年齡和攝入的量等因素而有所不同，例如大豆凝集素對(duì)反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)影響遠(yuǎn)小于其對(duì)單胃動(dòng)物的影響［13］；③影響腸道功能，大量植物凝集素可與大鼠的小腸黏膜上皮細(xì)胞結(jié)合，導(dǎo)致上皮細(xì)胞微絨毛萎縮、刷狀緣膜紊亂，使得上皮細(xì)胞的正常功能和發(fā)育能力下降［7］；④影響胰腺的結(jié)構(gòu)和功能，引起胰腺增生［14-16］；⑤刺激黏膜下的肥大細(xì)胞脫粒，從而引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)［17-20］。同時(shí)，某些植物凝集素進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)（尤其是兒童和幼齡動(dòng)物），能產(chǎn)生較強(qiáng)的IgE抗體，會(huì)加重機(jī)體過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生［21］。

3 植物凝集素的檢測(cè)方法

研究人員一直都在潛心研究植物凝集素的檢測(cè)方法，目前的相關(guān)檢測(cè)方法根據(jù)檢測(cè)原理的不同可分為三大類。

3.1 紅細(xì)胞凝集法

植物凝集素具有紅細(xì)胞凝集作用，即凝集素與紅細(xì)胞表面的糖結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生作用，使得凝集素分子在紅細(xì)胞之間形成多重交叉的橋狀結(jié)構(gòu)，從而造成紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象，同時(shí)凝集素的凝集活力（效價(jià)）與其量的多少呈線性關(guān)系。目前利用血凝反應(yīng)檢測(cè)植物凝集素活性的方法是應(yīng)用最為廣泛的植物凝集素檢測(cè)方法［19，22］。

測(cè)定凝集素活性的方法有96孔血凝板法、試管法、Liener法等，其中96孔血凝板法被廣泛應(yīng)用，該方法將動(dòng)物紅細(xì)胞（兔、豬、羊、人等動(dòng)物的紅細(xì)胞）配制成一定濃度的紅細(xì)胞懸液，再將其加入到經(jīng)過(guò)一定比例稀釋后的凝集素溶液中，放置一段時(shí)間后，可通過(guò)肉眼觀察或比色測(cè)定植物凝集素的凝血活性［19，23-24］。試管法是將各待測(cè)樣與細(xì)胞懸液混勻，于37℃下培養(yǎng)1.5 h的肉眼觀測(cè)血凝程度，然后在2 000 r/min下離心，棄去上清液。將裝有血凝細(xì)胞的試管于恒溫干燥箱中，105℃下干燥至恒重，冷卻、稱重，得干重量，以其多少評(píng)價(jià)血凝程度的高低［25］。

紅細(xì)胞凝集作用受到凝集素自身特點(diǎn)的影響，如糖結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量和分子大小；同時(shí)也受到細(xì)胞表面特性的影響，如受體部位的可及性或細(xì)胞膜的流動(dòng)性。同時(shí)也受到外部環(huán)境的影響，如溫度、細(xì)胞濃度等，此種檢測(cè)方法可對(duì)植物凝集素進(jìn)行定性或半定量的檢測(cè)［26］。

科學(xué)家們?yōu)榱诉M(jìn)一步提高凝集反應(yīng)的靈敏度和準(zhǔn)確度，進(jìn)行了多次改進(jìn)，比如將凝集反應(yīng)與分光光度法、激光濁度測(cè)定法、光散法和粒子計(jì)數(shù)法等方法相結(jié)合。紅細(xì)胞凝集法所使用的紅細(xì)胞可以是新鮮的動(dòng)物血紅細(xì)胞或者是新鮮的人血紅細(xì)胞，也可以使用經(jīng)過(guò)修飾后的紅細(xì)胞，凝集素對(duì)于不同來(lái)源的血紅細(xì)胞（如不同血型、不同動(dòng)物的血紅細(xì)胞等）表現(xiàn)出不同的凝集效果。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，通過(guò)對(duì)紅細(xì)胞的修飾，提高紅細(xì)胞對(duì)凝集素的靈敏度，可以較好地解決這個(gè)問題。比如，經(jīng)過(guò)一些蛋白酶（如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等）修飾后的紅細(xì)胞對(duì)大豆凝集素的靈敏度顯著增強(qiáng)。2006年，劉琳娜通過(guò)大豆凝集素與胰酶修飾紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)過(guò)胰蛋白酶處理后，兔紅細(xì)胞對(duì)大豆凝集素的靈敏度提高了4倍，豬紅細(xì)胞對(duì)大豆凝集素的敏感度提高了6～8倍，而且，原本不會(huì)發(fā)生凝集反應(yīng)的雞紅細(xì)胞在胰酶修飾后可發(fā)生凝集現(xiàn)象［27］。紅細(xì)胞凝集法具有易操作、耗時(shí)少等優(yōu)點(diǎn)，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)完成對(duì)大量樣品的檢測(cè)，在植物凝集素含量的初步測(cè)評(píng)中起著重要的作用，但是只有具有凝集活性的多價(jià)態(tài)的凝集素才可以使用該反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于在特殊條件下的單體或者活性功能片段因不能使紅細(xì)胞發(fā)生凝血反應(yīng)而無(wú)法使用該方法檢測(cè)。

3.2 糖復(fù)合物法

利用植物凝集素能特異性結(jié)合糖、糖蛋白或糖復(fù)合物的特性對(duì)植物凝集素進(jìn)行檢測(cè)的方法，即糖復(fù)合物法。該方法最早是將糖復(fù)合物標(biāo)記上放射性同位素后，與植物凝集素在一定溫度下孵育，由于糖復(fù)合物與凝集素的多價(jià)糖基結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生相互作用，且生成的結(jié)合物在高鹽濃度下易產(chǎn)生沉淀，而后借助離心或過(guò)濾等方法將結(jié)合物分離出來(lái)。通過(guò)檢測(cè)沉淀中放射性標(biāo)記的強(qiáng)度，可計(jì)算出標(biāo)記結(jié)合物的量以及結(jié)合常數(shù)，也可利用抑制劑或競(jìng)爭(zhēng)性底物對(duì)沉淀放射性強(qiáng)度的影響程度，計(jì)算出抑制劑或競(jìng)爭(zhēng)性底物的抑制常數(shù)或結(jié)合常數(shù)，再通過(guò)對(duì)這些抑制劑的抑制常數(shù)的比較可確定待測(cè)凝集素的專一性或結(jié)合活性，從而得出其含量［28］。根據(jù)Pusztai等建立的方法，楊麗杰等［29］利用玻璃板為支持體，在1%的瓊脂糖凝膠中加入半乳糖，緩沖液為pH 8.6的0.07 mol/L Tris-甘氨酸溶液，成功地對(duì)黑龍江幾個(gè)大豆品種中的凝集素進(jìn)行了定性和定量分析。

此外，為了克服紅細(xì)胞種類對(duì)凝集效果的影響，研究者提出一種新的方法，該方法是將具有與待測(cè)凝集素特異性結(jié)合位點(diǎn)的糖復(fù)合物，通過(guò)共價(jià)連接的方式結(jié)合聚苯乙烯膠粒表面，以此來(lái)替代紅細(xì)胞，此檢測(cè)方法的其他步驟與紅細(xì)胞凝集反應(yīng)基本相同［30］。這種方法避免了使用新鮮紅細(xì)胞帶來(lái)的不便和影響，還提供了測(cè)定凝集素糖結(jié)合特異性更為簡(jiǎn)便的方法。

3.3 抗原抗體免疫法

植物凝集素是一種蛋白質(zhì)，它可以作為抗原誘導(dǎo)特異性抗體的產(chǎn)生。由此可以采用一些免疫學(xué)的方法來(lái)測(cè)定植物凝集素，如采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）、火箭免疫電泳等方法或放射性免疫分析法（RIA）進(jìn)行定量分析［28，31］。這些免疫學(xué)方法都只能檢測(cè)植物凝集素的免疫學(xué)性質(zhì)，而不能反映植物凝集素的生物學(xué)功能活性，即不能準(zhǔn)確地反映出凝集素對(duì)紅細(xì)胞的凝集能力及其與腸壁細(xì)胞的結(jié)合能力和在體內(nèi)潛在的毒性作用。為了解決這個(gè)問題，研究人員建立了功能性凝集素免疫測(cè)定技術(shù)，該技術(shù)可對(duì)待測(cè)凝集素的生物毒性及其在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生的生物學(xué)作用進(jìn)行更確切的評(píng)價(jià)，如活性凝集素免疫分析法（FLIA）（將凝集素與包被在微滴定平板中的小腸刷狀緣細(xì)胞膜相結(jié)合）、刷狀緣凝集素凝集分析法（BBLAA）等［32-33］。

目前的植物凝集素免疫學(xué)檢測(cè)方法能夠有效地檢測(cè)出具有免疫活性的植物凝集素，但由于這些方法中所使用的抗體大多為抗凝集素的多克隆抗體。因多克隆抗體制備的特點(diǎn)，其成分較為復(fù)雜，使得現(xiàn)有的植物凝集素免疫學(xué)檢測(cè)方法在使用的范圍和標(biāo)準(zhǔn)化程度上受到了一定的限制。比如不同動(dòng)物種類和不同批次制備可能造成多克隆抗體樣品成分和效價(jià)不同等，這些因素都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性。利用細(xì)胞融合技術(shù)獲得的單克隆抗體具有純度高、特異性好、重復(fù)性好等特點(diǎn)，越來(lái)越多地被應(yīng)用到免疫學(xué)檢測(cè)中。近幾年，植物凝集素的檢測(cè)方法中出現(xiàn)了基于單克隆抗體的功能性植物凝集素免疫測(cè)定技術(shù)的研究。張海全等［34］以兔紅細(xì)胞膜作為載體，大豆凝集素純品作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，植物凝集素的單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，建立了檢測(cè)大豆凝集素含量的功能性酶聯(lián)免疫學(xué)方法。

4 展望

隨著食品、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥對(duì)植物資源的開發(fā)和利用，分析植物中的抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)——植物凝集素對(duì)其資源選育和利用以及食品安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，建立靈敏度更高、重復(fù)性更好、操作性更簡(jiǎn)便的植物凝集素檢測(cè)方法必將成為今后的發(fā)展方向。由于植物凝集素的檢測(cè)難度高于一般生化物質(zhì)，因而目前的各種檢測(cè)方法尚存在檢測(cè)穩(wěn)定性不高、靈敏度欠佳、無(wú)法實(shí)現(xiàn)真正意義上的高通量等問題。今后，國(guó)內(nèi)外的植物凝集素檢測(cè)方法的研究將向快速、便捷和高通量等方向發(fā)展，未來(lái)植物凝集素的檢測(cè)方法必將是多維而全面的。例如，將多種現(xiàn)有的檢測(cè)方法進(jìn)行聯(lián)用，從而達(dá)到準(zhǔn)確、高效檢測(cè)的目的。另一方面，植物凝集素檢測(cè)方法研究中，也將會(huì)應(yīng)用到更多的新技術(shù)，未來(lái)的發(fā)展方向?qū)?huì)集中在基因工程抗體的使用和改造、納米技術(shù)的應(yīng)用和多通路自動(dòng)化檢測(cè)方案的實(shí)現(xiàn)等方面的創(chuàng)新和改造，從而獲得更加靈敏、高效的檢測(cè)效果。