顧京晶

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院 410128；2.禽畜遺傳改良湖南省重點(diǎn)實(shí)驗室 410128）

生物功能基因組研究中的核心問題在于：如何在整體水平上解析基因與調(diào)控元件間、基因與基因間的互作，進(jìn)而了解生物在生命活動中涉及的基因復(fù)雜調(diào)控機(jī)制。在真核生物的細(xì)胞核內(nèi)，染色體遵循一定規(guī)律進(jìn)行三維折疊，基因的表達(dá)、調(diào)控，以及基因調(diào)控元件間的相互作用都基于復(fù)雜的染色體3D結(jié)構(gòu)。Bickmore和van Steensel在2013年的研究表明，染色體在分裂間期的細(xì)胞核內(nèi)存在長片段的核染色質(zhì)區(qū)間（包括異染色質(zhì)和常染色質(zhì)）和染色質(zhì)疆域，同時存在短片段的增強(qiáng)子——啟動子連接區(qū)域，這些染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)對細(xì)胞正常的基因表達(dá)和調(diào)控有重要影響[1]。啟動子不但與鄰近調(diào)控元件結(jié)合，而且與調(diào)控元件借助染色體三維結(jié)構(gòu)存在長距離遠(yuǎn)程調(diào)控機(jī)制。例如：Fullwood等人于2009發(fā)現(xiàn)在人乳腺癌細(xì)胞系MCF7中存在大量遠(yuǎn)程調(diào)控元件參與乳腺癌關(guān)聯(lián)基因的調(diào)控。Li等人于2012年在對多類癌癥細(xì)胞系的研究后發(fā)現(xiàn)，大量的啟動子與啟動子的遠(yuǎn)程相互作用、基因的共調(diào)控，是通過形成特定的染色質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)來進(jìn)行的，因此原本線性距離非常遠(yuǎn)的調(diào)控因子可以通過染色質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)，達(dá)到空間上的近距離接觸。眾多科學(xué)家們基于一系列染色質(zhì)構(gòu)象捕獲研究，發(fā)現(xiàn)了多種染色質(zhì)的交互作用類型和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)特征，其中包括啟動子與啟動子、增強(qiáng)子與啟動子的交互作用、染色質(zhì)區(qū)隔、染色質(zhì)拓?fù)洚悩?gòu)域、染色質(zhì)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這些研究成果表明，基于染色質(zhì)三維構(gòu)象的基因調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識正在不斷深入，三維基因組時代即將到來。迄今為止，對于三維基因組的研究主要集中在人類的正常以及癌細(xì)胞株、小鼠細(xì)胞株、酵母、果蠅、擬南芥和棉花中。

下面將從熒光原位雜交技術(shù)到Hi-C技術(shù)探討三維基因?qū)W研究所采用的技術(shù)手段。科學(xué)家們對染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)關(guān)注由來已久，從十九世紀(jì)開始到本世紀(jì)初，研究者以顯微鏡結(jié)合熒光原位雜交技術(shù)，對細(xì)胞核中染色質(zhì)上單個位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察研究，但這一階段研究受限于當(dāng)時的實(shí)驗技術(shù)，只能大略對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)做低分辨率解讀。隨著基因組研究的不斷深入和實(shí)驗技術(shù)的提高，Dekker等人在2002年對酵母的染色質(zhì)構(gòu)象進(jìn)行了研究，提出了稱為染色質(zhì)構(gòu)象捕獲（Capturing Chromosome Conformation,3C）的新技術(shù)。3C技術(shù)的要點(diǎn)為：在完整細(xì)胞狀態(tài)下，利用甲醛對DNA分子進(jìn)行原位固定，將交聯(lián)的蛋白質(zhì)和DNA分子固定下來，然后對染色質(zhì)片段進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切和臨位連接，獲得包含所有連接產(chǎn)物的DNA片段文庫，運(yùn)用獲得的片段數(shù)據(jù)計算出不同位點(diǎn)在染色質(zhì)上的交互頻率，從而推測出位點(diǎn)之間的空間距離，進(jìn)而繪制出染色質(zhì)的三維空間構(gòu)象交互圖譜。此后，科學(xué)家們在研究兩個或少數(shù)幾個位點(diǎn)之間的3C技術(shù)基礎(chǔ)上開發(fā)出了一系列衍生技術(shù)，如特定位點(diǎn)對多位點(diǎn)的4C（Circularized Chromosome Conformation Capture，4C），多位點(diǎn)對多位 點(diǎn) 的 5C（Carbon-Copy Chromosome Conformation Capture，5C），兩個或少數(shù)幾個位點(diǎn)之間的ChIP-3C，全基因組層面一個特定蛋白介導(dǎo)的所有位點(diǎn)對所有的ChIA-PET和全基因組層面所有位點(diǎn)對所有的Hi-C技術(shù)。在這些技術(shù)中，ChIA-PET和Hi-C技術(shù)都可以通過二代高通量測序技術(shù)獲得海量數(shù)據(jù)，從而建立高分辨率染色質(zhì)構(gòu)象圖譜。與ChIA-PET有所區(qū)別的是，Hi-C可以無偏差的在全基因組范圍捕捉到所有染色質(zhì)交互信息，在現(xiàn)階段已經(jīng)可得到最精細(xì)分辨率為1kb的染色質(zhì)構(gòu)象圖譜（由Rao等人在2014基于人淋巴母細(xì)胞系研究）[2]。Hi-C技術(shù)作為目前為止可無偏差解析全基因組范圍內(nèi)染色質(zhì)空間構(gòu)象的最有效方法，將有助于了解基因組的三維結(jié)構(gòu)，推動功能基因組學(xué)研究。