陳坤威，童亞林，姚詠明

固有免疫通常被認為是微生物感染的第一道防線，在過去的十幾年中，越來越多的證據(jù)顯示固有免疫細胞在機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、組織修復與再生中具有重要作用[1-3]。當組織損傷后，多種免疫細胞參與組織修復，其中固有免疫細胞起到至關重要的作用，了解固有免疫細胞在組織修復過程中的確切作用，特別是組織工程材料植入后的變化，能為未來設計出具有良好免疫調(diào)控性能的支架材料提供有益線索。組織工程支架材料的設計目標是能為創(chuàng)傷、疾病或先天畸形的患者提供一種組織缺損的替代物[4]。以往參與組織修復的支架材料通常需整合細胞及生物學信號，近年來的研究顯示單獨的支架材料成分也能起到促進組織修復與再生的作用。多項觀察證實，支架材料特性諸如材料成分、材料表面化學特性、理化特性(硬度、厚度、孔隙大小、化學基團修飾等)及材料的降解產(chǎn)物均可影響材料的免疫原性，對多種固有免疫細胞產(chǎn)生作用，出現(xiàn)宿主反應強度的差異性變化。本文擬對常見固有免疫細胞在組織損傷修復中的作用、組織工程支架材料特性對固有免疫系統(tǒng)的影響及潛在應用作一綜述。

1 固有免疫細胞與損傷修復

典型的組織損傷要經(jīng)歷炎癥期、增生期、重塑期/瘢痕形成期三個階段。免疫反應參與了組織損傷后修復與再生過程，持續(xù)時間數(shù)天至數(shù)周不等。固有免疫細胞是最早參與損傷后免疫反應的免疫細胞，通過抵御潛在病原體入侵損傷組織，第一時間起到防御作用。即使在沒有病原體入侵的情況下，免疫細胞也會被損傷組織中釋放的危險信號激活，產(chǎn)生無菌性炎癥。常見的固有免疫細胞包括中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞(dendritic cells，DC)。

中性粒細胞是免疫系統(tǒng)中數(shù)量最多的細胞，在組織損傷修復中表現(xiàn)出促進與抑制修復的雙重作用。一方面，中性粒細胞自身具有抗菌效應(產(chǎn)生抗菌肽、活性氧、蛋白酶)，同時可通過激活其他免疫細胞減少損傷組織的感染概率；另一方面，中性粒細胞分泌的蛋白酶(如絲氨酸蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶)及中性粒細胞來源的各種介質(zhì)會加重組織損傷，延長修復過程[5]。中性粒細胞分泌的細胞因子與生長因子，如IL-17及血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor α，VEGF-α)，能招募和活化更多的中性粒細胞及其他炎性細胞，促進血管生成，刺激成纖維細胞、表皮細胞及角化細胞的增殖[5]。中性粒細胞產(chǎn)生的中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)可以捕獲殺滅病原菌，提高中性粒細胞吞噬效應；但在組織損傷修復過程中，有證據(jù)表明中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)可能加重組織損傷，延長修復時間[6]。單核細胞及巨噬細胞能吞噬死亡的中性粒細胞及細胞碎片，中性粒細胞也可通過增加對單核細胞與巨噬細胞的招募表現(xiàn)出一部分抗炎能力，達到實現(xiàn)自我清除的目的，有助于炎癥的消散[7]。由于中性粒細胞在組織修復中的雙重作用，調(diào)控中性粒細胞的數(shù)量及功能可能成為促進組織修復與再生新的切入點。

巨噬細胞在免疫系統(tǒng)中一直扮演清道夫細胞的角色，吞噬細胞碎片、入侵的病原體及其他凋亡的細胞。除了傳統(tǒng)認識上的吞噬作用，越來越多的證據(jù)顯示，巨噬細胞還具有調(diào)節(jié)組織修復的效應[8]。組織損傷后，巨噬細胞是炎癥反應中多種趨化因子、基質(zhì)金屬酶及炎癥介質(zhì)的主要來源[9]。在損傷初期，減少巨噬細胞數(shù)量可以使炎癥反應明顯減輕，然而，缺少巨噬細胞同時也導致組織愈合及再生效率下降[10]。巨噬細胞主要存在兩種極化狀態(tài)，分別為促炎M1型巨噬細胞與抗炎M2型巨噬細胞，多項研究證明巨噬細胞的不同活化狀態(tài)在組織修復、再生、纖維化中具有重要意義。目前普遍認為促炎型M1型巨噬細胞雖然能清除損傷部位的微生物及碎片，但在組織修復過程中會加重組織損傷，影響組織修復結局；而M2型巨噬細胞表現(xiàn)為促進組織修復與再生[11]。組織損傷炎癥反應高峰期過后，M2型巨噬細胞數(shù)量上逐漸處于優(yōu)勢，產(chǎn)生大量促進細胞增殖及血管生成的生長因子，包括血小板來源的生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、轉化生長因子(transforming growth factor β1，TGF-β1)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor 1，IGF-1)及VEGF-α，產(chǎn)生溶解性介質(zhì)促進組織成纖維細胞分化成肌成纖維細胞，同時合成細胞外基質(zhì)成分，加快損傷部位收縮閉合[8]。在體外實驗中，M1型巨噬細胞能被干擾素-γ(IFN-γ)或TNF-α誘導產(chǎn)生，而M2型巨噬細胞則被IL-4或IL-13誘導產(chǎn)生，且根據(jù)刺激因素的不同，巨噬細胞的功能也會出現(xiàn)差異。IL-4活化產(chǎn)生的M2型巨噬細胞表達多種損傷修復因子，然而若持續(xù)受到IL-4刺激，巨噬細胞則促進病理性纖維化的形成[1]。IL-6及IL-21能上調(diào)巨噬細胞IL-4受體的表達，當巨噬細胞受到IL-4或IL-13刺激后，IL-6及IL-21能促進具有抗炎及抗纖維化功能的巨噬細胞產(chǎn)生[1,8]。鑒于巨噬細胞在組織修復各階段所起到的作用，深入了解巨噬細胞在不同微環(huán)境下的功能變化，進一步對巨噬細胞功能進行調(diào)控，對提高組織修復能力具有重要意義。

DC是機體內(nèi)重要的抗原提呈細胞，與巨噬細胞類似，DC也具有在損傷部位吞噬微粒及處理危險信號的能力。雖然目前對DC在組織修復與再生中的確切作用尚未充分闡明，但已有資料提示DC在組織修復過程中具有不可替代的作用[9-11]。例如，漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cells，pDCs)能通過Toll樣受體(TLR)7與TLR9識別皮膚損傷處的核酸，并產(chǎn)生Ⅰ型干擾素參與傷口愈合修復[12]。Vinish等[13]發(fā)現(xiàn)，DC缺乏的小鼠燒傷創(chuàng)面出現(xiàn)明顯的閉合延遲。此外，在小鼠心梗模型中，DC缺乏的小鼠相對于正常小鼠心梗后左心功能障礙及心室重構明顯加重，進一步觀察發(fā)現(xiàn)在缺血梗死部位促炎M1型巨噬細胞浸潤增加，抗炎型M2型巨噬細胞數(shù)量明顯減少[14]。因此，DC可能通過調(diào)節(jié)巨噬細胞的動態(tài)平衡發(fā)揮調(diào)控損傷修復的作用。

2 生物材料支架與異物反應

組織工程生物材料支架作為損傷組織的替代物在臨床上已被廣泛應用，支架材料的成分廣義分為天然材料與合成材料。臨床上使用的組織工程支架材料通常需要整合信號或細胞以提高材料的組織修復性能，如各類化學信號、生長因子、間充質(zhì)干細胞等。目前，關于材料本身免疫原性的調(diào)控參與組織修復過程研究逐漸成為熱點，通過改變材料特性以提高材料的組織相容性，減少或避免材料引起的異物反應、纖維包裹及其他有害的降解產(chǎn)物對組織修復的影響。

當生物材料支架植入機體與血液接觸后，材料表面即附著上一層蛋白質(zhì)，促進富含生長因子、細胞因子及趨化因子的血凝塊(臨時基質(zhì))的形成，臨時基質(zhì)招募固有免疫細胞到損傷部位形成肉芽腫；肉芽腫逐漸形成瘢痕組織并最終完成損傷修復，在此過程中還有異物巨細胞的出現(xiàn)，這些繼發(fā)性的變化是材料植入體內(nèi)引起異物反應的全過程[11]。異物反應常難以避免，過度的異物反應可以延長組織愈合的時間，增加瘢痕組織的形成，對創(chuàng)面的損傷愈合起到負向調(diào)節(jié)作用。材料植入體內(nèi)所導致急慢性炎癥的嚴重程度由植入材料的類型、臨時基質(zhì)形成程度及炎癥消散所需時間決定[11]。因此，有關支架材料的研究希望通過改變上述因素起到調(diào)節(jié)機體炎癥免疫強度，達到促進組織修復、降低異物反應程度及瘢痕組織形成的目的。

3 組織工程支架材料特性對固有免疫反應的影響

3.1 支架主要成分 Park等[15-16]研究發(fā)現(xiàn)，多種生物材料薄膜(藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖、透明質(zhì)酸及聚乳酸)能引起DC不同程度地活化，分泌不同水平的細胞因子。例如，聚乳酸、殼聚糖、藻酸鹽引起DC促炎細胞因子的釋放；聚乳酸、殼聚糖誘導CD80、CD86、CD83及CD44表達增高；透明質(zhì)酸則引起較低水平CD40、CD80、CD86及人類白細胞抗原(HLA)-DR表達及較低水平促炎因子的產(chǎn)生，并進一步刺激T細胞表面分子CD4、CD8、CD25、CD9表達及不同細胞因子改變(IFN-γ、IL-10、IL-4)，且DC與瓊脂糖共培養(yǎng)后誘導CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生。

在另一項關于支架成分免疫原性研究中，來源于機體不同組織的細胞外基質(zhì)支架材料，包括小腸黏膜下層、膀胱、骨骼肌、腦、食道、皮膚、肝臟和結腸，可引起巨噬細胞向不同的表型極化。小腸黏膜下層、腦組織、食道及結腸來源的細胞外基質(zhì)材料誘導巨噬細胞向M2型極化，皮膚來源的支架材料誘導巨噬細胞往M1型方向極化。實驗結果提示，不同組織來源支架材料成分的免疫原性存在明顯差異[17]。

3.2 表面化學特性

3.2.1 表面形貌學 Chang等[18]研究顯示，中性粒細胞黏附在較粗糙的聚苯乙烯表面后死亡速度明顯加快，可能與其黏附在粗糙材料表面產(chǎn)生更多的氧自由基有關。另一項實驗中，與表面光滑的鈦材料相比，表面輕度粗糙的鈦材料使巨噬細胞分泌促炎細胞因子增多，如TNF-α、IL-1β等，表明表面較粗糙的材料更容易引起炎癥反應[19]。本文第一部分提及，炎癥可能是延緩損傷愈合的關鍵性因素之一，因此選擇表面較光滑的材料可能具有較好的組織相容性，引起更少的炎癥反應，對組織的修復更有利。

3.2.2 表面電勢 雖然目前有文獻論述了生物材料表面電勢對免疫細胞的影響，但材料表面電荷的確切作用仍然沒有明確[20]。據(jù)報道，納米桿氨基末端帶表面正電荷，誘導巨噬細胞向抗炎M2型方向極化；而納米桿的羧基末端帶表面負電荷，誘導巨噬細胞向促炎的M1型極化[21]。Neumann等[22]觀察到帶正電荷的殼聚糖納米微粒能激活炎性體，促進IL-1β的分泌，具有促炎效應。采用羥基聚乳酸乙醇酸(polylactic-co-glycolic acid，PLGA)、聚苯乙烯或微鉆石所合成的微粒，都帶表面負電荷，能夠抑制巨噬細胞向促炎型M1型巨噬細胞極化[23]。

3.2.3 表面親水性與疏水性 Alfarsi等[19]發(fā)現(xiàn)表面經(jīng)過親水改性后的鈦金屬材料引起巨噬細胞分泌更少的TNF-α、IL-1α、IL-1β等炎性細胞因子。另據(jù)報道，在電中性親水性聚合物材料上觀察到較少的巨噬細胞黏附，以及較少的異物巨細胞形成，但比較電中性親水材料上的巨噬細胞和其他兩種非電中性疏水材料上的巨噬細胞，證實細胞因子(IL-1、IL-6、IL-8及IL-10)的產(chǎn)生明顯增多[24]。由此可見，親水性材料引起炎癥反應可能比疏水性材料要輕微，在生物材料的選擇上，增加親水性材料的比例可能更有利于炎癥的控制及組織損傷修復。

3.2.4 表面涂層 通過材料表面涂層修飾可有效降低蛋白質(zhì)的吸附及白細胞黏附，CD47是一種廣泛存在的跨膜蛋白，通常作為一個“自我識別”的標記物。有研究發(fā)現(xiàn)，預先用CD47涂在高分子聚氯乙烯(PVC)上可明顯降低中性粒細胞的聚集與黏附[25]，提示選擇組織相容性較好或免疫反應較低的表面涂層材料，可通過減少材料表面的中性粒細胞的數(shù)量，降低材料與組織的免疫炎癥反應，進而有益于損傷修復。

3.3 理化特性

3.3.1 孔徑大小及孔隙率 近年來，許多資料提示表面材料的孔隙影響機體固有免疫反應。Sussman等[26]觀察到異物反應強度在有孔材料與無孔材料間存在明顯差異，有孔材料引起較少的纖維包圍及更高的血管生成率。進一步分析證實，材料孔隙影響巨噬細胞極化，在孔隙內(nèi)巨噬細胞極化方向明顯偏向M1型，M2型巨噬細胞數(shù)量相對減少；而在孔隙外，M2型巨噬細胞比例明顯增加，且當孔隙大小在34μm時，孔隙內(nèi)M1型巨噬細胞比例最高。雖然有孔材料能通過改變巨噬細胞功能促進組織修復，但孔隙對材料的機械強度同時也存在負面影響[27]。Kim等[27]將等量的致孔劑分別與不同質(zhì)量的聚乙丙交酯(PLG)制成不同孔隙率的三種材料，在體外細胞種植實驗中，發(fā)現(xiàn)孔隙率大的材料能獲得更多的DC細胞。然而體內(nèi)實驗結果則恰恰相反，三種材料中較低孔隙率材料招募的DC數(shù)量最多，原因是高孔隙率材料在植入體內(nèi)后由于機械強度降低出現(xiàn)明顯的壓縮現(xiàn)象，導致孔隙壓縮變小，因此在設計帶孔隙支架材料時，需考慮其機械強度的變化。由于不同特質(zhì)的材料最佳的孔徑大小可能存在較大差異，不同材料可能還需要進一步檢測其最佳孔徑大小，且在保證具有足夠機械強度的前提下，盡可能增加材料的孔隙率可能使材料對巨噬細胞的影響朝著M2型方向極化更有利，也更有利于創(chuàng)面愈合。

3.3.2 硬度 Blakney等[28]將巨噬細胞培養(yǎng)在抗壓系數(shù)(硬度)分別為130、240、840kPa的聚乙二醇水凝膠上，發(fā)現(xiàn)不同抗壓系數(shù)的水凝膠不會影響巨噬細胞在材料上的附著，但會引起細胞形態(tài)改變，巨噬細胞形態(tài)在130kPa的水凝膠上呈圓形，但在更高抗壓系數(shù)的水凝膠上，巨噬細胞形態(tài)會被拉伸，并且巨噬細胞培養(yǎng)在抗壓系數(shù)較低的水凝膠上，產(chǎn)生的TNF-α、IL-1β、IL-6水平較培養(yǎng)在抗壓系數(shù)較高的水凝膠上低。同樣，將材料植入小鼠皮下后發(fā)現(xiàn)，抗壓系數(shù)最低的水凝膠引起的異物反應最弱。嚴重的異物反應不利于組織損傷修復，選擇抗壓系數(shù)低的材料在組織修復愈合方面的應用可能較系數(shù)高的材料更有優(yōu)勢。

3.3.3 厚度 Wang等[29]從基因水平探討了材料厚度對巨噬細胞功能的影響，結果顯示巨噬細胞移動抑制因子-1(macrophage migration inhibitory factor-1，MIF-1)基因表達與M1型巨噬細胞極化密切相關，選擇活化型巨噬細胞的特異性標志物精氨酸酶-1(arginase-1，Arg-1)和發(fā)現(xiàn)于炎癥區(qū)域-1(found in inflammatory zone-1，F(xiàn)izz-1)基因與M2型巨噬細胞極化關系密切。研究還顯示，較厚的(大約5μm)電紡絲聚已內(nèi)酯(PCL)材料能誘導巨噬細胞向M2型極化，抗炎細胞因子Arg-1及Fizz-1基因表達明顯上調(diào)；較薄的(大約0.5μm)PCL材料則更傾向誘導巨噬細胞往M1型方向極化，IL-6、TNF-α、MIF-1基因表達明顯增加。故在同一種材料的選擇上，較薄的材料可能比較厚的材料促炎效應更明顯，更不利于創(chuàng)面閉合。此外，較厚的支架材料還具有更好的促進血管再生作用。

3.3.4 空間結構 3D組織工程支架材料在組織工程學中是一個新興的研究領域，隨著3D材料應用于創(chuàng)傷修復與再生醫(yī)學研究的陸續(xù)開展，關于組織工程支架材料的3D結構對固有免疫細胞影響的報道逐漸增多。Daneshmandi等[30]在研究膠原/殼聚糖納米支架3D結構對DC成熟的影響中證明，對比2D環(huán)境下培養(yǎng)，在3D支架結構培養(yǎng)下DC表面分子CD40、CD86、MHC Ⅱ表達和細胞因子IL-12、IL-6、TNF-α分泌明顯增加，與T淋巴細胞共培養(yǎng)時IFN-γ、IL-4釋放水平也比2D環(huán)境下增多。Friedemann等[31]在膠原(Coll)、透明質(zhì)酸(HA)、高度硫酸化透明質(zhì)酸(sHA)空間結構的對比實驗中發(fā)現(xiàn)，2D膠原材料促使巨噬細胞分泌更多IL-10、IL-12和TNF-α，2D條件下透明質(zhì)酸及高度硫酸化透明質(zhì)酸IL-12及TNF-α分泌量較低，但IL-10分泌量比3D條件下增多。同樣，3D殼聚糖支架的幾何結構能夠影響單核細胞TNF-α及IL-12、IL-23的產(chǎn)生，設計時在結構上用更大孔徑及更大角度的殼聚糖3D支架材料誘導產(chǎn)生更多TNF-α[32]。

3.3.5 化學基團修飾 化學基團修飾是組織工程學材料改性常用的一種技術手段，但增加或減少某些化學基團可能會對材料的免疫原性產(chǎn)生影響。殼聚糖是甲殼素脫N-乙?；漠a(chǎn)物，有學者發(fā)現(xiàn)不同乙?；潭饶苡绊懢奘杉毎麡O化，乙酰化程度為15%的3D多孔殼聚糖支架材料有較多炎性細胞浸潤，引發(fā)巨噬細胞分泌IL-6、TNF-α明顯增加，誘導巨噬細胞向M1型極化；與之相反，乙酰化程度為5%的殼聚糖材料中炎性細胞黏附數(shù)量相對較少，能檢測到較高水平IL-4的分泌，巨噬細胞呈現(xiàn)M2型特性[33]。Franz等[34]采用膠原與高度硫酸化透明質(zhì)酸組成的復合涂層材料(Coll/hsHA)培養(yǎng)巨噬細胞，對比其輕度硫酸化的復合涂層材料(Coll/lsHA)及未硫酸化的復合涂層材料(Coll/HA)，發(fā)現(xiàn)高度硫酸化涂層材料能明顯減少巨噬細胞分泌促炎細胞因子(TNF-α、IL-12)，并增加巨噬細胞抗炎細胞因子IL-10的產(chǎn)生，且分泌細胞因子水平與透明質(zhì)酸硫酸化程度相關。生物材料中基團的添加在以往的材料設計中主要是考慮改變材料某方面的機械特性，但通過改變材料的化學基團進而影響免疫細胞功能的方法，可以為未來的材料設計提供一種全新的設計思路。

3.3.6 交聯(lián) 交聯(lián)是增加組織工程學材料機械特性常用的方法，據(jù)報道，藻酸鹽用鈣離子交聯(lián)形成的藻酸鈣水凝膠能明顯增強DC活化，同時也明顯增加IL-1β的分泌。同樣情況下，改用鋇離子交聯(lián)，并未出現(xiàn)IL-1β分泌增多。藻酸鹽水凝膠是組織工程中常用的材料，且經(jīng)常用鈣離子交聯(lián)增加其機械強度，這項研究提示鈣離子交聯(lián)后可能影響材料的免疫原性，因此材料設計需單獨考慮鈣離子的促炎效應[35]。

3.4 降解產(chǎn)物 許多藥物傳遞系統(tǒng)與組織工程學方法都使用可降解的生物材料作為載體或支架，隨著材料在體內(nèi)降解的同時可能伴有材料理化性能改變，目前需要迫切地了解隨著生物材料的降解、特性改變及副產(chǎn)品的形成，生物材料免疫原性是如何發(fā)生變化的。早期關于生物材料降解的影響主要集中在透明質(zhì)酸的研究上。在相關實驗中，透明質(zhì)酸被酶解形成各種分子量大小的片段，觀察對DC免疫功能的影響，結果顯示低分子量的透明質(zhì)酸(1500-5300D)通過觸發(fā)TLR2及TLR4信號通路，能增強DC活化、促進TNF-α分泌及T淋巴細胞增殖活性[36]。在巨噬細胞實驗中，發(fā)現(xiàn)低分子量透明質(zhì)酸可誘導巨噬細胞向M1型極化，而高分子量透明質(zhì)酸誘導巨噬細胞向促進組織修復與愈合的M2型巨噬細胞極化[37]。趨化因子CCL2可誘導趨化巨噬細胞在損傷部位聚集，是常見的巨噬細胞趨化因子，有證據(jù)表明，在一項關于殼聚糖降解產(chǎn)物促進神經(jīng)修復的研究中，殼聚糖的降解產(chǎn)物殼寡糖(chitooligosaccharides，COS)具有通過改善巨噬細胞構建的微環(huán)境進而促進神經(jīng)修復的作用；進一步分析發(fā)現(xiàn)，COS作用在施旺細胞miR-327/CCL2靶點上，通過下調(diào)其miR-327進而誘導CCL2的表達，從而調(diào)控巨噬細胞在損傷部位的聚集，實現(xiàn)損傷部位微環(huán)境的重構及促進神經(jīng)的再生[38]。另有兩項獨立實驗證實，不同大小納米材料[39]及不同形狀納米材料[40]能導致免疫系統(tǒng)不同程度地活化，說明支架材料降解后形成的不同大小片段及形狀各異的降解產(chǎn)物同樣會對免疫系統(tǒng)造成影響。

綜上所述，通過免疫調(diào)節(jié)改善損傷修復預后是一個非常復雜的病理生理過程，不同組織損傷修復形成的局部微環(huán)境都不盡相同。組織工程材料特性對免疫系統(tǒng)的影響使我們認識到一個全新的、有價值的免疫治療領域。業(yè)已明確，材料的成分、理化性質(zhì)等諸多特性均能改變材料本身的免疫原性，對材料免疫特性的分析，有助于指導未來組織工程設計出更優(yōu)化的具有免疫調(diào)控性能的支架材料，更加高效安全地促進組織的愈合與再生。值得指出的是，材料的不同特性也存在復雜的交互作用，相關免疫調(diào)控效應研究非常有限，需要更加深入的探索和了解，以促進其更快更好地向臨床轉化應用。