肖寧 唐蓉玉 金彬 信澤祥 王建峰 趙劃晟 黃初陽 戴潤林 龍永福

膀胱癌在全世界惡性腫瘤中居第11位，其中尿路上皮癌占大部分。局限性尿路上皮癌可分為非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)和肌層浸潤性膀胱癌(MIBC)，其中NMIBC占據(jù)75%，而且50%的MIBC患者最終發(fā)生轉(zhuǎn)移[1-2]。丹參酮ⅡA (tanshinoneⅡA， TanⅡA) 是中藥丹參的有效成分，研究發(fā)現(xiàn)其具有明顯的抗癌作用[3-4]。TanⅡA可以誘導(dǎo)尿路上皮癌T24細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移，但是具體機(jī)制并不明晰[5]。本研究通過建立T24細(xì)胞小鼠膀胱癌移植瘤模型，在體內(nèi)研究TanⅡA對膀胱癌的增殖抑制，以及對極光激酶A (Aurora A)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α (HIF-1α) 和B淋巴細(xì)胞瘤-2基因 (Bcl-2) 表達(dá)的影響，進(jìn)而探討TanⅡA的抗癌機(jī)制。

材料與方法

一、細(xì)胞及試劑

人膀胱癌細(xì)胞株T24購自上海門諜塔生物科技發(fā)展有限公司。DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；Trizol總RNA提取試劑(美國Invitrogen公司)；引物合成及內(nèi)參(上海生工生物工程公司)。

二、儀器

RT-PCR儀(美國Abi公司)；水平電泳槽(北京君意東方儀器公司)；DG-Ⅲ雙穩(wěn)數(shù)顯電泳儀(北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心)；高速離心機(jī)(德國Sigma公司)。

三、膀胱癌T24細(xì)胞動物模型的建立

正常培養(yǎng)T24細(xì)胞，約3 d傳1代，至一定數(shù)量后開始各項分組操作。以1×107/ml細(xì)胞濃度，注射雄性BALB/-nu裸鼠(4～6 W周齡)，每注射點(diǎn)接種總體積0.2 ml，選擇雙側(cè)腰肋區(qū)皮下。飼養(yǎng)裸鼠至第7天，開始測量瘤體大小(最長徑a和最短徑b，1次/3 d，連續(xù)6次)。以時間為橫坐標(biāo)，腫瘤體積為縱坐標(biāo)，繪制腫瘤增殖曲線。腫瘤體積按照公式計算，V=a×b2×0.52(mm3)。

四、動物分組及給藥方法

接種T24細(xì)胞1周后，20只裸鼠模型隨機(jī)分為對照組和TanⅡA組，每組10只。對照組(n=10)給予生理鹽水腹腔內(nèi)注射，TanⅡA組(n=10)給予TanⅡA(15 mg/kg)腹腔內(nèi)注射，1次/3 d，末次給藥24 h后，處死小鼠。

五、RT-PCR檢測腫瘤組織中Aurora A、HIF-1α和Bcl-2 mRNA表達(dá)

將腫瘤組織剪成小塊后，每份樣品取約30 mg，用勻漿器充分研磨樣品，按Trizol試劑說明書提取RNA，紫外分光光度法檢測RNA純度和濃度。按照熒光定量PCR試劑盒說明書，加入PCR反應(yīng)物進(jìn)行擴(kuò)增。Aurora A：上游引物5′-GCTGG-AGAGCTTAAAATTGCA-3′，下游引物5′-TTTGTAGGTCTCTTGGTATG-3′；HIF-1α：上游引物5′-CACCACAGGACAGTACAGGAT-3′，下游引物5′-CGTGCTGAATAATACCACTCACA-3′；Bcl-2：上游引物5′-GGTGGGGTCATGTGTGTGG-3′，下游引物5′-CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC-3′；內(nèi)參基因β-actin：上游引物5′-CATTAAGGAGAAGCTGTGCT-3′，下游引物5′-GTTGAA-GGTAGTTTCGTGGA-3′。利用2-ΔΔCT法[6]及軟件計算基因的相對表達(dá)量。

六、統(tǒng)計學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng)計分析使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)之間采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TanⅡA對膀胱癌裸鼠模型腫瘤增殖的影響

經(jīng)腹腔注射TanⅡA能夠明顯抑制裸鼠模型皮下膀胱癌的增殖，其抑制程度隨時間增長而增加，呈時間依賴性。尤其是在第25天，其差值最大，使腫瘤體積降低51.3%，差異明顯(P<0.01)(圖1)。

圖1 TanⅡA對于裸鼠皮下膀胱癌增殖的影響(*P<0.05；**P<0.01)

二、TanⅡA對裸鼠皮下膀胱癌組織中Aurora A、HIF-1α和Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

與對照組相比，TanⅡA能夠顯著降低膀胱癌組織中Aurora A(P<0.000 1)、HIF-1α(P=0.004 7)和Bcl-2(P=0.000 5)mRNA表達(dá)水平(圖2～4)。

圖2 TanⅡA對于裸鼠皮下膀胱癌組織中Aurora A mRNA表達(dá)的影響(**P<0.01)

圖3 TanⅡA對于裸鼠皮下膀胱癌組織中HIF-1α mRNA表達(dá)的影響(**P<0.01)

圖4 TanⅡA對于裸鼠皮下膀胱癌組織中Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響(**P<0.01)

討 論

TanⅡA是中藥丹參的提取物，具有脂溶性，既往用于治療心血管疾病，具有抗氧化、抗炎等特點(diǎn)[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TanⅡA具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡的作用，并且可通過抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，對結(jié)腸癌、食管癌、肝細(xì)胞癌、肺癌、胃癌及卵巢癌等具有潛在的抗腫瘤作用[8]。Chiu等[5]對包括T24在內(nèi)的多種膀胱細(xì)胞株進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TanⅡA通過caspase和線粒體依賴途徑誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡，呈時間和濃度依賴性，提示TanⅡA對于膀胱癌存在潛在的抗腫瘤作用。

本研究在Chiu等[5]的研究基礎(chǔ)上進(jìn)行裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TanⅡA能夠明顯抑制動物裸鼠模型皮下膀胱癌的增殖，呈時間依賴性，然后通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)TanⅡA可以顯著降低裸鼠膀胱癌組織中Aurora A、HIF-1α和Bcl-2 mRNA表達(dá)的水平，提示TanⅡA可能通過降低上述3個因子的表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用。

HIF-1α是缺氧條件的組織標(biāo)志物之一，作為腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境的核轉(zhuǎn)錄因子，被認(rèn)為是腫瘤生長及血管生成的關(guān)鍵因子之一，可以增加腫瘤細(xì)胞對放、化療的抵抗性，在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)[9]。研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α可能通過PI3K/AKT/mTOR、MAPK以及ERK途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[10]。近來研究發(fā)現(xiàn)TanⅡA能通過抑制HIF-1α信號通路減輕脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷，但是在低氧環(huán)境下的抗腫瘤機(jī)制并不明晰[11]。因此，本研究發(fā)現(xiàn)TanⅡA可能通過降低HIF-1α轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，但是具體信號途徑還需進(jìn)一步研究。

Aurora A和Bcl-2被認(rèn)為與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)，其功能異常會引起細(xì)胞有絲分裂以及凋亡調(diào)控的紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生[12-13]。我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)人類膀胱癌組織中Aurora A和Bcl-2呈高表達(dá)[14]，可能與膀胱癌的進(jìn)展相關(guān)，而且本研究從整體水平提示TanⅡA可能通過降低Aurora A和Bcl-2轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。我們推測，Aurora A和Bcl-2可能單獨(dú)或者協(xié)同發(fā)揮調(diào)控作用，但是需要通路轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的證明。

雖然，通過本研究發(fā)現(xiàn)TanⅡA在體內(nèi)可能通過降低Aurora A、HIF-1α和Bcl-2轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化，抑制膀胱癌裸鼠移植瘤的生長。但是，由于在TanⅡA組中未能設(shè)置不同濃度組，對其在裸鼠體內(nèi)抗膀胱癌作用的濃度依賴性研究不足。因此，在下一步研究其相關(guān)調(diào)控通路時，應(yīng)對TanⅡA在不同濃度時對膀胱癌的作用以及對正常組織細(xì)胞的影響進(jìn)行研究。

綜上所述，本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TanⅡA存在抗膀胱癌作用，并且發(fā)現(xiàn)可能通過影響細(xì)胞周期及低氧誘導(dǎo)機(jī)制發(fā)揮作用，但是具體的信號通路及相互調(diào)控還需進(jìn)一步研究。同時，由于TanⅡA具有植物類藥物的低毒性，因此TanⅡA有望成為治療晚期膀胱癌新的、低毒和高效的藥物。