汪寧 王榮江 鐘歡 湯建兒 陳煜 高建國(guó)

腎癌是泌尿生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率約占全身惡性腫瘤的3%[1]。腎癌缺乏放化療敏感性，治療方式以根治性手術(shù)為主，如出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移則延誤最佳治療時(shí)機(jī)[2]，因此尋找有效的腎癌標(biāo)志物對(duì)指導(dǎo)疾病診斷、治療及判斷預(yù)后都具有重要的臨床意義。動(dòng)力蛋白輕鏈家族包括Tctex-1(Dynlt-1)、Dynlt-3、Dynll-1、Dynll-2、Dynrb-1、Dynrb-2。Tctex-1的編碼基因位于6q25.2，分子量12 kDa，含有113AA，是由2個(gè)α螺旋和4個(gè)β鏈組成的二聚體。它主要富集在間質(zhì)成纖維細(xì)胞的高爾基體上，同時(shí)在間期微管和核膜上也能檢測(cè)到[3]。文獻(xiàn)報(bào)道Tctex-1參與人乳頭瘤病毒等感染從而影響宮頸癌的發(fā)生過(guò)程[4]，然而，Tctex-1與腎細(xì)胞癌的作用機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)沉默Tctex-1基因觀察對(duì)腎癌786-O細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響，并探索其下游信號(hào)通路，為腎癌的治療提供可能的靶點(diǎn)。

材料與方法

一、材料

Tctex-1、Wnt和VDAC1抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；786-O細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)購(gòu)自日本同仁化學(xué)株式會(huì)社；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。

二、體外化學(xué)合成小干擾RNA(siRNA)

應(yīng)用Ambion公司提供的網(wǎng)上在線工具設(shè)計(jì)Tctex-1特異性的siRNA。序列：5′-TCAGATGGACAGTCCGAAGG-3′(反義)，5′-ATGCGTTAAAGATGGAAGACTTC-3′(正義)。

三、細(xì)胞轉(zhuǎn)染與實(shí)驗(yàn)分組

常規(guī)消化收集細(xì)胞后，將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板。待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為70%～80%時(shí)，按照LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為Tctex-1-siRNA轉(zhuǎn)染組及陰性對(duì)照組。

四、Western blot檢測(cè)Tctex-1、Wnt和VDAC1蛋白表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，提取總蛋白，按每條泳道總蛋白30 μg加樣，于SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑(美國(guó)ProteinSimple公司)檢測(cè)結(jié)果。

五、CCK-8檢測(cè)Tctex-1對(duì)786-O細(xì)胞增殖能力的影響

將轉(zhuǎn)染48 h后的786-O細(xì)胞以200 μl/孔(約5×103個(gè)細(xì)胞)鋪于96孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并分別在細(xì)胞貼壁后的1、2、3、4 d后按照CCK-8說(shuō)明書(shū)向各孔中加入CCK-8與無(wú)血清培養(yǎng)液(1∶10)混合物110 μl，避光孵育30 min后于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度(OD)值。

六、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)786-O細(xì)胞遷移及侵襲能力

24孔板中先加入600 μl含20%胎牛血清的對(duì)應(yīng)培養(yǎng)液，取200 μl(1.5×108/L)轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞懸液加入Transwell小室，侵襲實(shí)驗(yàn)取200 μl(2.0×108/L)的轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞懸液加入Transwell小室，事先將Matrigel膠與無(wú)血清培養(yǎng)液按1∶6比例稀釋配制出混合液，取50 μl混合液平鋪于Transwell小室中。將小室放入有培養(yǎng)液的24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后取出小室吸干其中的液體，移到90%甲醇中固定30 min，用結(jié)晶紫染色30 min，用棉簽擦凈小室底部，然后將小室倒過(guò)來(lái)背朝上晾干，于顯微鏡下拍照，取5個(gè)隨機(jī)視野，統(tǒng)計(jì)每個(gè)隨機(jī)視野中的細(xì)胞個(gè)數(shù)。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、Western blot檢測(cè)786-O細(xì)胞中Tctex-1、Wnt和VDAC1蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染組(Tctex-1-siRNA組)中Tctex-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量為(0.185±0.041)，對(duì)照組(NCi組)為(0.762±0.065)；Tctex-1-siRNA組中Wnt蛋白的相對(duì)表達(dá)量為(0.302±0.034)，NCi組為(0.819±0.049)；Tctex-1-siRNA組中VDAC1蛋白的相對(duì)表達(dá)量為(0.208±0.051)，NCi組為(0.688±0.050)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與NCi組相比，Tctex-1-siRNA組中Tctex-1、Wnt和VDAC1蛋白表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1)。

二、CCK-8法檢測(cè)Tctex-1基因?qū)?86-O細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在2、3、4 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)Tctex-1-siRNA組OD值與NCi組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2 dP<0.05，3、4 dP<0.01)(圖2)。表明沉默Tctex-1基因的表達(dá)，786-O細(xì)胞增殖能力明顯降低。

三、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Tctex-1基因?qū)?86-O細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

如圖3所示，Tctex-1-siRNA組中遷移細(xì)胞數(shù)為(63±6)個(gè)，NCi組中遷移細(xì)胞數(shù)為(132±11)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而Tctex-1-siRNA組中侵襲細(xì)胞數(shù)為(45±5)個(gè)，NCi組中侵襲細(xì)胞數(shù)為(105±9)個(gè)，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。表明沉默Tctex-1基因的表達(dá)，786-O細(xì)胞遷移及侵襲能力明顯降低。

圖1 Western blot檢測(cè)Tctex-1-siRNA組與NCi組中Tctex-1、Wnt及VDAC1蛋白表達(dá)

圖2 CCK-8法檢測(cè)Tctex-1-siRNA組與對(duì)照組中細(xì)胞增殖能力情況(*P<0.05；**P<0.01)

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Tctex-1-siRNA組與NCi組中細(xì)胞遷移及侵襲能力情況(×400)

討 論

胞質(zhì)動(dòng)力蛋白是由輕鏈、中間鏈、重鏈等組成的多亞基蛋白復(fù)合體，能將生物能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能，通過(guò)微管運(yùn)動(dòng)進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸。在有絲分裂中胞質(zhì)動(dòng)力蛋白可促進(jìn)中心體分離、核膜解體、紡錘體組裝[5-6]；還能與動(dòng)力激活蛋白相結(jié)合，從而驅(qū)動(dòng)染色體分離以及膜性細(xì)胞器運(yùn)輸。Tctex-1作為一種重要的細(xì)胞因子，參與多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，如介導(dǎo)逆行囊泡運(yùn)輸、參與直接的物質(zhì)運(yùn)輸、參與免疫功能調(diào)節(jié)、病毒感染、細(xì)胞的破骨過(guò)程等，同時(shí)也參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及遷移過(guò)程[7]。研究發(fā)現(xiàn)Tctex-1在90%的乳腺癌中高表達(dá)，并作為p21活化酶1的底物，與Pak1形成復(fù)合物促進(jìn)乳腺癌發(fā)生、生長(zhǎng)及乳腺癌細(xì)胞存活[8]，提示Tctex-1可能是一種促癌因子。

利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Tctex-1和VDAC1有相互作用，并且通過(guò)免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)Tctex-1與VDAC1密切相關(guān)[9]。Tctex-1與VDAC1的相互作用能在缺氧的環(huán)境抑制線粒體通透性增加。而多種惡性腫瘤的VDAC1表達(dá)增加與HK結(jié)合產(chǎn)生抗凋亡作用，腫瘤細(xì)胞處于一種缺氧環(huán)境，這提示在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能有Tctex-1與VDAC1的相互作用使腫瘤抗凋亡。而本研究中發(fā)現(xiàn)Tctex-1-siRNA轉(zhuǎn)染組中VDAC1蛋白表達(dá)量明顯降低，這提示抑制Tctex-1表達(dá)能抑制下游通路因子VDAC1表達(dá)，從而影響腫瘤細(xì)胞凋亡與侵襲。

通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Tctex-1與Dkk-3相互作用。免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Tctex-1與Dkk-3共定位于人成纖維細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)附近[10-12]。研究表明Dkk-3是Wnt信號(hào)通路的拮抗因子，Dkk-3可通過(guò)Wnt/β-catenin經(jīng)典通路來(lái)抑制腫瘤發(fā)展[13]。而本研究中發(fā)現(xiàn)Tctex-1-siRNA轉(zhuǎn)染組中Wnt蛋白表達(dá)量明顯降低，這提示Tctex-1可能與Dkk-3相互作用，從而作用于下游通路信號(hào)因子Wnt，影響腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移。

本研究利用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法干擾786-O細(xì)胞中Tctex-1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示Tctex-1對(duì)腎癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲具有調(diào)控作用。Tctex-1-siRNA轉(zhuǎn)染組中Tctex-1蛋白表達(dá)低于陰性對(duì)照組，說(shuō)明Tctex-1-siRNA成功抑制了786-O細(xì)胞中Tctex-1蛋白表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用CCK-8法、細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)觀察了抑制Tctex-1蛋白表達(dá)對(duì)786-O細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，研究發(fā)現(xiàn)沉默Tctex-1蛋白后786-O細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力受到抑制，說(shuō)明Tctex-1作為促癌基因存在，這為Tctex-1成為腎癌的潛在治療靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為探討Tctex-1參與腎癌發(fā)生、發(fā)展作用機(jī)制搭建了研究基礎(chǔ)。

本研究從生物功能上證實(shí)沉默Tctex-1基因表達(dá)可以有效抑制腎癌細(xì)胞的增殖，降低其遷移及侵襲能力，從機(jī)制上證實(shí)沉默Tctex-1基因可以有效抑制下游信號(hào)通路因子Wnt、VDAC1基因表達(dá)。由此可見(jiàn)Tctex-1基因與腎癌具有相關(guān)性，干擾Tctex-1基因的表達(dá)可能成為治療腎癌的一個(gè)新靶點(diǎn)，下一步工作將從腎癌的組織表達(dá)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步深入探討。