劉陳黎 廖錦先 李茂章 周曉波 陳佳

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最為常見(jiàn)的一種惡性腫瘤。盡管我國(guó)膀胱癌發(fā)病率遠(yuǎn)低于西方國(guó)家，但也是居高不下，男性膀胱癌發(fā)病率位居全身惡性腫瘤的第七位，女性排在第十位以后[1]。由于我國(guó)各個(gè)地區(qū)醫(yī)療水平的不平衡，許多患者就診時(shí)腫瘤已進(jìn)展為中晚期，因此尋找膀胱癌早期診斷和預(yù)后指標(biāo)十分迫切。緊密連接在保持尿路上皮細(xì)胞間細(xì)胞極性和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中扮演著重要的角色[2]。VSIG1(V-set and immunoglobulin domain containing 1)是緊密連接黏附分子家族成員之一，研究發(fā)現(xiàn)，VSIG1在正常胃黏膜及睪丸生殖細(xì)胞呈高表達(dá)，而在胃癌、食管癌等腫瘤組織中的表達(dá)明顯下降[3]。本研究采用Western blot及免疫組織化學(xué)法對(duì)膀胱尿路上皮癌中VSIG1蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)VSIG1基因與膀胱尿路上皮癌的發(fā)生和發(fā)展具有一定相關(guān)性。現(xiàn)報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

一、一般資料

2015年1月至2017年6月于我院接受膀胱根治性切除且臨床及病理資料完整的50例膀胱腫瘤患者納入研究。50例中男41例、女9例。年齡51～73歲，平均年齡(64.3±5.7)歲。按照WHO尿路腫瘤組織學(xué)分類法進(jìn)行分類，50例中肌層浸潤(rùn)性尿路上皮癌32例、非肌層浸潤(rùn)性乳頭狀尿路上皮癌18例(其中高級(jí)別13例、低級(jí)別5例)。初發(fā)腫瘤34例、復(fù)發(fā)腫瘤16例。

二、方法

1.Western blot方法檢測(cè)組織中VSIG1蛋白的表達(dá)：①取相同質(zhì)量大小的冷凍組織(尿路上皮腫瘤組織及距離腫瘤邊緣3～5 cm的正常膀胱黏膜組織)，將RIPA裂解液加入組織中裂解，然后12 000 rmp 4 ℃離心30 min后收集裂解液；②將20 μg蛋白樣本加入12% SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離；③將凝膠內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜；④將PVDF膜置入5%脫脂牛奶封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)1 h；⑤一抗(山羊抗人VSIG1抗體，1∶1 000，R&D Systems)4 ℃過(guò)夜孵育PVDF膜；⑥PBST洗滌4遍，辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的兔抗山羊lgG抗體(1∶2 000，Proteintech Group)37 ℃孵育PVDF膜60 min，特異性探針檢測(cè)結(jié)合位點(diǎn)；⑦PBST洗滌4遍，將增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)物加至蛋白條帶，條帶密度通過(guò)Image J軟件進(jìn)行計(jì)算。采用GAPDH蛋白作為內(nèi)參(一抗小鼠抗人GAPDH單克隆抗體，Abcam公司)共檢測(cè)了20對(duì)膀胱尿路上皮癌及癌旁組織。

2.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)VSIG1基因的表達(dá)：對(duì)5 μm的組織切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟至水，在0.01 mol/L加熱沸騰的檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)中漂洗3×3 min使抗原修復(fù)，于室溫下自然冷卻，在PBS下進(jìn)行3×5 min的漂洗，并在漂洗完成后滴入3%的過(guò)氧化氫，室溫下孵育10 min，同時(shí)在0.01 mol/L的PBS中漂洗3×5 min，在非免疫血清的濕盒中室溫下孵育30 min，并去除多余的血清(勿洗)，加入一抗(山羊抗人VSIG1抗體，1∶200，R&D Systems)，在4 ℃的環(huán)境下孵育過(guò)夜，并在0.01 mol/L的PBS中漂洗3×5 min，低價(jià)生物素標(biāo)記的二抗室溫下孵育30 min，同時(shí)需要在0.01 mol/L的PBS中漂洗3×5 min，最后低價(jià)鏈霉素抗生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物室溫下孵育20 min，并在0.01 mol/L的PBS中漂洗3×5 min，滴入DAB顯色液進(jìn)行顯色，使用自來(lái)水進(jìn)行沖洗將反應(yīng)終止，可以使用蘇木素再次染色，并使用1%的鹽酸酒精進(jìn)行數(shù)秒鐘的分色，流水進(jìn)行沖洗，并用0.1%的氨水進(jìn)行返藍(lán)處理，最后使用鏡檢方法進(jìn)行檢測(cè)，并以陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照。共檢測(cè)了50對(duì)癌組織及癌旁組織標(biāo)本。

三、評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不重疊并完整的高倍視野，測(cè)定視野下反映的陽(yáng)性面積，所有標(biāo)本VSIG1免疫染色的強(qiáng)度和范圍經(jīng)雙盲測(cè)定，陽(yáng)性染色比例評(píng)分為0(0%～9%)、1(10%～25%)、2(26%～50%)和3(51%～100%)；強(qiáng)度評(píng)分為0(無(wú)著色)、1(輕度著色)、2(適中著色)和3(深度著色)；總評(píng)分為強(qiáng)度和范圍的綜合(0～9)，VSIG1表達(dá)水平定義為0分陰性(-)、1～3分弱陽(yáng)性(+)、4～6分陽(yáng)性(++)、7～9分強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，癌組織與癌旁組織間VSIG1蛋白表達(dá)水平的比較采用Student't檢驗(yàn)，VSIG1表達(dá)與臨床病理資料的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、膀胱癌組織中VSIG1蛋白的表達(dá)

Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，20對(duì)中有13例冷凍膀胱尿路上皮癌組織標(biāo)本VSIG1的表達(dá)較其相對(duì)應(yīng)的癌旁正常膀胱黏膜組織明顯下降。其中3對(duì)的表達(dá)比較見(jiàn)圖1。

圖1 3對(duì)膀胱尿路上皮癌組織及癌旁正常黏膜組織VSIG1蛋白的表達(dá)(C：癌組織；N：癌旁組織)

二、石蠟包埋膀胱尿路上皮癌組織塊中VSIG1基因的表達(dá)

免疫組織化學(xué)法分析結(jié)果顯示，所有50例癌組織標(biāo)本中，67% VSIG1表達(dá)陰性(-)，33% VSIG1弱陽(yáng)性表達(dá)(+)；50例相對(duì)應(yīng)的癌旁組織中能夠見(jiàn)到較高密集分布的棕黃色顆粒，VSIG1呈高表達(dá)狀態(tài)(++)。見(jiàn)圖2。

三、不同病理分級(jí)和臨床分期膀胱尿路上皮癌組織中VSIG1的表達(dá)

將免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果與患者的臨床基本資料進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，VSIG1基因的表達(dá)和腫瘤的TNM分期存在相關(guān)性，不同T分期及N分期之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但不同年齡及性別的患者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

A：癌旁組織，VSIG1表達(dá)(++)；B：低級(jí)別膀胱尿路上皮癌組織(T1N0M0)，VSIG1表達(dá)(+)；C：高級(jí)別膀胱尿路上皮癌組織(T3N1M0)，VSIG1表達(dá)(-)圖2 石蠟包埋組織中VSIG1的免疫組織化學(xué)分析(×40)

一般資料例數(shù)VSIG1(+)VSIG1(-)χ2P值總數(shù)50(100.0)1337性別 男41(82.0)10310.3070.580 女9(18.0)36年齡(歲) ≥6036(72.0)9270.0670.796 <6014(28.0)410TNM分期 T分期 T118(36.0)999.1480.010 T225(50.0)421 T3～T47(14.0)07 N分期 N035(70.0)12234.1630.041 N1～N315(30.0)114

討 論

膀胱尿路上皮癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其最初臨床表現(xiàn)多為間歇、無(wú)痛性全程肉眼血尿，也有部分患者為鏡下血尿，隨著病情的發(fā)展，可能出現(xiàn)尿頻、尿急、尿痛，甚至排尿困難等不適癥狀。盡管多數(shù)為低級(jí)別尿路上皮癌，但術(shù)后極易復(fù)發(fā)，且部分膀胱癌患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]，若不及時(shí)采取有效的治療措施，會(huì)嚴(yán)重危害患者的身體健康，甚至威脅到患者的生命。膀胱癌的病因較為復(fù)雜，不僅有內(nèi)在因素，同時(shí)也有外在的環(huán)境因素。而其發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因、多因素參與的復(fù)雜的病理生理過(guò)程[5]。明確與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因及其作用機(jī)制，篩選膀胱癌生物學(xué)標(biāo)志物并進(jìn)一步分析其對(duì)膀胱癌發(fā)生和進(jìn)展的作用有著重要的臨床價(jià)值。

VSIG1是免疫球蛋白超家族成員，更確切地說(shuō)是緊密連接黏附分子家族成員。VSIG1基因位于染色體Xq22.1上，是一種單克隆基因，長(zhǎng)度約34 kb，包含7個(gè)外顯子，不同的外顯子分別編碼蛋白不同的區(qū)域。VSIG1蛋白包括含有233個(gè)氨基酸的細(xì)胞外區(qū)域，23個(gè)氨基酸的跨膜區(qū)域，以及131個(gè)氨基酸的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域。該蛋白分子量為45～70 kDa。VSIG1 mRNA的表達(dá)高度局限于正常組織，研究者通過(guò)免疫組織化學(xué)方法對(duì)31種不同正常組織的VSIG1表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)只有正常胃黏膜及睪丸生殖細(xì)胞存在VSIG1高表達(dá)，而在胃癌、食管癌及卵巢癌等組織中其表達(dá)水平有不同程度的下降。Chen等[6]研究發(fā)現(xiàn)，VSIG1在胃癌組織中的表達(dá)較正常胃黏膜明顯下降，且與腫瘤的惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，其可能的機(jī)制是，VSIG1參與了細(xì)胞間緊密連接功能，當(dāng)表達(dá)下降時(shí)，緊密連接結(jié)構(gòu)受到破壞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

本研究應(yīng)用Western blot檢測(cè)了20對(duì)膀胱尿路上皮癌及癌旁正常膀胱黏膜組織中VSIG1蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VSIG1蛋白在膀胱尿路上皮癌組織呈低表達(dá)，而在同一患者的癌旁正常組織中呈中高表達(dá)。這與VSIG1在其他部位腫瘤組織中的表達(dá)是相似的[3]。可以判定VSIG1作為緊密連接黏附分子同樣參與了膀胱正常黏膜組織的結(jié)構(gòu)和生理功能。

本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)膀胱尿路上皮癌組織中VSIG1蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)67%的膀胱尿路上皮癌未見(jiàn)明顯VSIG1蛋白表達(dá)，33%表達(dá)弱陽(yáng)性，相比之下，癌旁正常膀胱黏膜幾乎都可見(jiàn)VSIG1蛋白陽(yáng)性表達(dá)。通過(guò)分析我們發(fā)現(xiàn)，這67%VSIG1表達(dá)陰性的患者大多數(shù)是高級(jí)別尿路上皮癌患者。結(jié)合所檢測(cè)的50例膀胱尿路上皮癌患者的臨床病理資料，發(fā)現(xiàn)VSIG1表達(dá)強(qiáng)度與性別和年齡無(wú)明顯相關(guān)，但與TNM分期顯著相關(guān)，T、N分期級(jí)別越高，VSIG1表達(dá)強(qiáng)度越弱，腫瘤惡性程度與VSIG1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這提示VSIG1在膀胱癌的進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，可能是腫瘤細(xì)胞VSIG1表達(dá)下降，細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)受到破壞，使得癌細(xì)胞可以輕松地發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，但具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究未行M分期與VSIG1表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性分析，原因是所有標(biāo)本均來(lái)源于行膀胱全切術(shù)患者，而發(fā)生膀胱癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者一般不接受膀胱全切術(shù)。但在胃癌的研究中已證實(shí)VSIG1陰性表達(dá)與M分期顯著相關(guān)[6]。

本研究顯示，VSIG1有可能是一種抑癌基因，其在膀胱尿路上皮癌組織中的失表達(dá)極有可能會(huì)促進(jìn)膀胱尿路上皮癌的發(fā)生和進(jìn)展。在患者膀胱黏膜組織中高表達(dá)VSIG1基因，可能有助于抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，對(duì)患者的臨床早期診斷以及治療有一定的指導(dǎo)性作用。因此，我們將進(jìn)一步探索VSIG1基因在膀胱尿路上皮癌組織中表達(dá)降低的相關(guān)機(jī)制，以期對(duì)膀胱癌患者的早期診斷和預(yù)后判斷提供臨床依據(jù)。