趙小峰， 吳桂梅， 金 磊， 汪 瑤， 顏景芝

(1.徐州醫(yī)科大學國家級基礎醫(yī)學實驗教學示范中心，江蘇徐州 221004；2.江蘇省腦病生物信息重點實驗室/徐州醫(yī)科大學生物化學與分子生物學研究中心，江蘇徐州 221004)

海人藻酸受體(kainate receptors，簡稱KARs)是屬于離子型谷氨酸受體(ionotropic glutamate receptors，簡稱iGluRs)的一類受體，通過與谷氨酸結合來介導中樞神經(jīng)元的快興奮性傳導，參與突觸傳遞、神經(jīng)調節(jié)等神經(jīng)活動，與腦功能障礙、神經(jīng)退行性疾病(癲癇、孤獨癥、精神分裂癥等)有密切關系[1]。神經(jīng)纖毛和特羅德樣蛋白質(neuropilin and tolliod-like proteins，簡稱Neto)是篩選視網(wǎng)膜功能基因時發(fā)現(xiàn)的1種Ⅰ型跨膜蛋白質[2]，包括Neto1和Neto2 2種類型。研究表明，Neto1和Neto2是海人藻酸受體僅有的2個輔助亞基[3-4]，Neto蛋白質在大腦中分布廣泛，可通過與KARs的不同亞基結合，調節(jié)KARs在突觸中的定位和生理特性，進而影響受體通道的脫敏作用及突觸轉運[1]。但Neto蛋白質調節(jié)KARs的結構基礎、作用機制還不清楚。本研究利用生物信息學工具對家兔Neto2蛋白質進行預測與研究，旨在為進一步研究家兔Neto2蛋白質在生理和病理條件下的作用及其對KARs功能調控機制提供試驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從GeneBank獲得家兔和其他物種Neto2蛋白質的氨基酸序列。在線分析工具為Blast(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)、BepiPred(http：//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)、ExPASy(http：//ca.expasy.org)、DTU Bioinformatics(http：//www.cbs.dtu.dk)。

1.2 方法

利用生物信息學在線工具研究家兔Neto2蛋白質的理化性質(http：//web.expasy.org/protparam/)、疏水性(http：//web.expasy.org/protscale)、二級結構(http：//www.biogem.org/tool/chou-fasman/)、跨膜結構域(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、信號肽(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、亞細胞定位(http：//www.genscript.com/psort.html)、三級結構(https：//swissmodel.expasy.org/)、功能基序(http：//smart.embl-heidelberg.de)、糖基化位點(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)、磷酸化位點(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)，最后使用MEGA6.05軟件和String工具研究Neto2蛋白質的分子進化關系、相互作用的蛋白質。

2 結果與分析

2.1 理化性質

家兔Neto2分子式為C2 608H4 049N703O777S33，含518個氨基酸殘基，由20種基本氨基酸組成，氨基酸殘基數(shù)、含量見表1。家兔Neto2蛋白質分子量為58 742.06 u，等電點為 6.34，含帶正電荷的氨基酸殘基(賴氨酸+精氨酸)60個，帶負電荷的氨基酸殘基(谷氨酸+天冬氨酸)64個。在體外，家兔Neto2的半衰期在哺乳動物細胞中為30 h，在酵母 中>20 h，在大腸桿菌中>10 h。蛋白質的不穩(wěn)定指數(shù)為 43.62，根據(jù)蛋白質穩(wěn)定參數(shù)在40以下為穩(wěn)定蛋白質的標準，推測家兔Neto2蛋白質屬于不穩(wěn)定蛋白質[5]。脂溶系數(shù)為73.78，總平均親水系數(shù)(grand average of hydropathi city，簡稱GRAVY)為-0.329，說明該蛋白質為親水蛋白質[6](正值為疏水性，負值為親水性，介于-0.5～0.5之間主要為兩性蛋白質)。這與ProtScale軟件分析的結果(圖1)一致，圖中顯示，大部分氨基酸分值為較低的負值，表明這些氨基酸具有較強的親水性。

2.2 二級結構分析

進入二級結構在線分析工具，選擇參數(shù)：窗口參數(shù)(windowwidth)為17，相似度(similarity threshold)為8，狀態(tài)數(shù)(number of states)為4，由圖2可知，家兔Neto2蛋白質二級結構中α-螺旋占30.69%(159個氨基酸殘基)，延伸鏈占19.88%(103個氨基酸殘基)，β-轉角占4.25%(22個氨基酸殘基)，無規(guī)則卷曲占45.17%(234個氨基酸殘基)。

表1 家兔Neto2的氨基酸組成

2.3 信號肽和跨膜結構預測

采用SignalP 4.1對家兔Neto2蛋白質進行分析發(fā)現(xiàn)，第23位氨基酸的最高原始剪切位點得分是0.490，同時該位點綜合剪切分值最高，為0.655，第16個氨基酸信號肽的得分最高，0.942，第1～22個氨基酸信號肽的平均得分為 0.774，趨向于+1，表明家兔Neto2蛋白質存在信號肽(界限值為0.45)，最可能的切割位點在22和23氨基酸殘基(VEG-IA)之間(圖3)。經(jīng)分析家兔Neto2蛋白質存在跨膜結構，1～338位于膜外，339～361為跨膜區(qū)，362～518位于膜內(nèi)(圖4)。

2.4 糖基化和磷酸化位點分析

經(jīng)NetOGlyc 4.0分析，家兔Neto2蛋白質存在糖基化位點，分別是第184、284位的絲氨酸殘基和291位的蘇氨酸殘基，得分依次為0.658 779、0.683 538和0.522 623。對家兔Neto2蛋白質進行磷酸化分析發(fā)現(xiàn)，有62個磷酸化位點(得分>0.5)(圖5)，其中絲氨酸36個，蘇氨酸16個，酪氨酸10個。推測不同的位點可被不同的激酶引發(fā)磷酸化。

2.5 功能結構分析

使用GORⅣ、SMART對家兔Neto2蛋白質的功能結構域進行分析，結果(圖6)表明，該蛋白質含2個CUB和1個LDLa保守結構域，2個CUB位于45～159、177～292位氨基酸殘基處，LDLa位于296～333位氨基酸殘基處。C端含有1個復合螺旋區(qū)(coiled coil regions，綠色方形區(qū))(404～432位氨基酸殘基處)，在N端(3～27位氨基酸殘基處)還有1個低復雜性區(qū)域，此外在346～368位氨基酸殘基處為跨膜區(qū)域(藍色方形區(qū))。

2.6 亞細胞定位

亞細胞定位預測結果表明，家兔Neto 2蛋白質主要存在于內(nèi)質網(wǎng)(44.4%)、線粒體(44.4%)中，細胞核(11.1%)中也有少量分布。Neto2蛋白質在內(nèi)質網(wǎng)、線粒體中定位較多，說明蛋白質主要發(fā)揮受體、運輸及結合的作用[7]。

2.7 三級結構及蛋白質相互作用分析

采用同源建模法預測家兔Neto2蛋白質三級結構，第42～237位氨基酸殘基參與建模，模板為3kq4.1.B Cubilin。由圖7可知，在三級結構中蛋白質無規(guī)卷曲、折疊延伸鏈分布較多，而α-螺旋分布較少，這與二級結構中預測的結構元件分布大致相同。

String數(shù)據(jù)庫是搜索已知蛋白質之間及與預測未知蛋白質之間相互作用的在線工具。這種作用包括蛋白質之間直接的物理相互作用及蛋白質之間間接的功能相關性。本研究采用String數(shù)據(jù)庫對家兔Neto2蛋白質進行蛋白質相互作用(protein-protein interaction，簡稱PPI)分析，若關聯(lián)系數(shù)>0.4，則認為相互作用顯著[8]。通過String在線搜索發(fā)現(xiàn)，一些與家兔Neto2相互作用的蛋白質，這些蛋白質包括氨基末端鈣結合蛋白質1(n-terminal EF-hand calcium binding protein 1，簡稱Necab1)、氨基末端鈣結合蛋白質2(Necab2)、與酪氨酸磷酸化生長因子相關的銜接蛋白質NCK1、SH2結構域連接蛋白質1(SHC binding and spindle associated 1，簡稱SHCBP1)、谷氨酸鹽受體海人藻酸5(glutamate receptor ionotropic kainate 5，簡稱Grik5)、甲硫氨酰-tRNA合成酶2(methionyl-tRNA synthetase 2，簡稱MARS2)、二甲基甘氨酸脫氫酶前體(dimethylglycine dehydrogenase precursor，簡稱Dmgdh)、肌氨酸脫氫酶(sarcosine dehydrogenase，簡稱SARDH)、乙酰輔酶A合成酶(acetyl-CoA synthetase 2，簡稱ACSS2)等，由圖8可知，家兔Neto2蛋白質參與調節(jié)谷氨酸受體活性、β-淀粉樣蛋白質(Aβ)生成及神經(jīng)細胞的記憶調節(jié)等活動。

2.8 蛋白質系統(tǒng)進化分析

采用MEGA6.05軟件構建系統(tǒng)進化樹，由圖9可知，嚙齒目的小家鼠、褐家鼠、黃金倉鼠聚為一類，再與兔形目的家兔相聚類。靈長目的東非狒狒、人、獼猴和黑猩猩聚為1類；食肉目的雪貂和靈長目聚為1類，之后又與食肉目家犬聚為1類；偶蹄目的綿羊、山羊、家牛聚為1類；奇蹄目的家馬和驢聚為1類，再與偶蹄目、食肉目及靈長目相聚類。在Neto2基因遺傳進化上，家兔與嚙齒目親緣關系最近，與偶蹄目、奇蹄目、食肉目及靈長目親緣關系較遠，與鳥綱、兩棲綱、魚綱之間親緣關系更遠。

3 討論

KARs是脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中谷氨酸鹽離子通道蛋白質，廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)。KARs由5種亞基(GluK1-5)[9]組成，在突觸傳遞、神經(jīng)元興奮、樹突生長、神經(jīng)發(fā)育等生命活動中發(fā)揮重要作用[10-12]。Neto2蛋白質是新發(fā)現(xiàn)的KARs輔助亞基，通過調節(jié)KARs的通道特性來影響其功能。Neto2與KARs的GluK2亞型結合，可增加GluK2受體開放概率和脈沖時間，加速脫敏恢復，從而提高KARs穩(wěn)態(tài)電流[13]。Sheng等發(fā)現(xiàn)，Neto2通過與GluK1氨基末端區(qū)(ATDs)結合協(xié)助GluK1進行突觸轉運[14]。Tang等研究發(fā)現(xiàn)，Neto2的C-末端盤狀同源區(qū)域(PDZ)結合結構域可以與谷氨酸受體相互作用蛋白(glutamate receptor-interacting protein，簡稱GRIP)相互作用，同時GRIP可以與GluK2的PDZ結合結構域結合，過表達Neto2可增強GRIP與GluK2的結合，從而增加KARs在突觸后膜的穩(wěn)定性[15]。Vernon等研究發(fā)現(xiàn)，Neto2蛋白質高表達于新生背根神經(jīng)，在坐骨神經(jīng)損傷或者敲除基因Neto2后，活化的絲裂原活化蛋白激酶/胞外信號調節(jié)激酶(MEK/ERK)上調Neto2的表達，進而調節(jié)軸突的再生及KARs在感覺神經(jīng)元中的作用[16]?，F(xiàn)有研究表明，Neto2蛋白質對KARs的調節(jié)具有多樣性，深入研究Neto2調控KARs的機制，將有可能為進一步研究癲癇、阿爾茲海默癥、疼痛及中風等疾病的治療方法提供試驗基礎和理論依據(jù)。

本研究通過對家兔Neto2蛋白質的分子特征進行分析發(fā)現(xiàn)，家兔Neto2蛋白質由518個氨基酸殘基組成，其中大部分氨基酸具有較強的親水性，說明該蛋白質易溶于水。家兔Neto2蛋白質含有信號肽，主要定位于內(nèi)質網(wǎng)、線粒體等細胞器內(nèi)。信號肽不僅決定蛋白質是否為分泌蛋白質，也和蛋白質在細胞內(nèi)的定位有關[17]。說明該蛋白質為分泌蛋白質，在內(nèi)質網(wǎng)中合成，能通過囊泡運輸至相應細胞區(qū)域，具有運輸和結合作用。

蛋白質磷酸化是調節(jié)和控制蛋白質活力和功能最基本、最普遍、最重要的機制，在細胞信號轉導的過程中起重要作用。糖基化可以改變蛋白質的構象，增加蛋白質的穩(wěn)定性，從而調節(jié)蛋白質眾多生物學功能[18]。分析結果表明，家兔Neto2蛋白質中存在62個磷酸化位點，3個糖基化位點，且推測家兔Neto2蛋白質為不穩(wěn)定蛋白質。因此，磷酸化和糖基化可使家兔Neto2變得穩(wěn)定，在細胞發(fā)育、細胞間信號傳遞和神經(jīng)細胞功能調節(jié)等活動中受蛋白質激酶的調節(jié)。據(jù)此，筆者推測蛋白質的磷酸化、糖基化修飾對家兔Neto2蛋白質的生物學功能具有重要的調節(jié)作用。

分子進化即微觀進化，依賴于核酸和蛋白質的序列信息，是闡明物種間相互關系的分子基礎[19-20]。通過系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，家兔Neto2蛋白質與小家鼠、褐家鼠、黃金鼠之間的關系最近，表明Neto2蛋白質在家兔和小家鼠、褐家鼠、黃金鼠中相對保守。家兔Neto2蛋白質二級結構中無規(guī)卷曲、α-螺旋含量較高，三級結構中長鏈卷曲分布較多。家兔Neto2蛋白質可以和Necab1、Necab2、NCK1、SHCBP1、Grik5等蛋白質發(fā)生相互作用，說明家兔Neto2蛋白質具有磷酸化活性，在生長發(fā)育、跨膜運輸、突觸傳遞、KARs信號轉導及β-淀粉樣蛋白質生成等過程中可能發(fā)揮重要作用。本研究對家兔Neto2蛋白質的理化性質、結構特征、進化關系等進行初步分析，為進一步研究家兔Neto2蛋白質的表達和生物活性奠定了工作基礎。