林時榮 ，宋秋月 ，羅東 ，李培群 ，鄒立津 ，陳開森

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，1、急診科；2、南昌大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院；3、檢驗科；4、燒傷科，南昌 330006)

金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus，SA）（簡稱金葡菌）是醫(yī)院、社區(qū)及畜牧業(yè)重要的病原體，常易導(dǎo)致皮膚及軟組織感染，由于該菌可產(chǎn)生多種侵襲性酶類、毒力因子及形成耐多藥的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 （Methcillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA），故治療棘手[1-3]。由于該菌易在患者間傳播，而采用分子生物學(xué)分型方法對臨床分離菌株進(jìn)行同源性分析可有效地監(jiān)測是否為感染傳播導(dǎo)致，從而為流行病學(xué)控制提供依據(jù)。南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷科為江西省重點學(xué)科，為區(qū)域性燒傷診治中心，雖然該病區(qū)的金葡菌感染率高，但這些分離菌株的特征、耐藥特性及同源關(guān)系被了解甚少。本研究將對我院燒傷科2015年分離的臨床金葡菌進(jìn)行回顧性分析，了解菌株的特征及同源性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2015年1月至2015年12月我院燒傷科分離的非重復(fù)金葡菌67株，所有菌株用生物梅里埃公司VITEK-2 compact（法國）儀器鑒定。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213和ATCC43300。

1.2 抗菌藥物 青霉素、頭孢曲松、頭孢西丁、紅霉素、林可霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、利福平、萬古霉素、復(fù)方新諾明和呋喃妥因為儀器自帶，所有藥物測定均采用MIC法（梅里埃公司配套的GP67卡）。

1.3 主要試劑與儀器 哥倫比亞瓊脂粉購自英國Oxoid公司；革蘭陽性鑒定卡（GP卡）及配套藥敏卡（GP67）購于生物梅里埃公司；DNA marker、PCR MIX購于上海生物工程有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒購于碧云天生物科技有限公司（江蘇海門）。PCR儀購自美國ABI公司；電泳儀購自北京六一公司；凝膠成像系統(tǒng)購自賽默飛時爾公司（美國）。PCR引物由上海生物工程有限公司合成。

1.4 MRSA菌株表型檢測 根據(jù)2014年CLSI M100S（第24版）準(zhǔn)則，篩選MRSA采用的是頭孢西丁MIC法，ATCC25923和ATCC43300為陰性和陽性質(zhì)控菌株。

1.5 DNA模板提取 從純培養(yǎng)的哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上挑取過夜培養(yǎng)菌落8-10個到1ml無菌TE緩沖液中，加入20μl的溶菌酶（終濃度20mg/ml），充分混勻離心沉淀，37℃水浴 30min，最后采用CTAB法提取菌株DNA。

1.6 MecA基因篩查 擴(kuò)增上下游引物，分別為：F：5’-GTGAAGATATACCAAGTGATT-3’；R：5’-ATG CGCTATAGATTGAAAGGAT-3’，產(chǎn)物大小 147bp。反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 45s，72℃ 30s共計30個循環(huán)，最后延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠電泳確定。

1.7 SCCmec分型 參照文獻(xiàn)設(shè)計引物[4]。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 10min；94 變性 30s，65℃退火 45s，72℃延伸 90s共計 30個循環(huán)，最后 72℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析，從而確定MRSA的亞型。

1.8 毒力因子檢測 本研究測定的毒力基因包括殺白細(xì)胞素（PVL）、耐熱核酸酶（Nuc）和血漿凝固酶（Coa）共計3個。引物設(shè)計、反應(yīng)條件等參照文獻(xiàn)[5-7]。具體相同Spa X區(qū)核苷酸序列的菌株則純化Nuc PCR產(chǎn)物及Coa PCR產(chǎn)物送上海生物工程有限公司雙向測序，產(chǎn)物拼接后采用MegAlign軟件分析，觀察核苷酸序列是否相同。

1.9 Spa基因檢測 PCR擴(kuò)增Spa基因X區(qū)，上、下游引物序列分別為5’-AGACGATCCTTCGGTGAGC-3’ 和 5’-GCTTTTGCAATGTCATTTACTG-3’；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5min；94 變性 30s，58℃退火45s，72℃延伸30s共計30個循環(huán)，最后72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠電泳確定，陽性結(jié)果純化后送上海生物工程有限公司雙向測序，測序結(jié)果經(jīng)雙向拼接處理后，與數(shù)據(jù)庫（http：//www.ridom.de/spaserver/)中公布的堿基重復(fù)序列比較，從而確定菌株的spa型別。

1.10 Spa X區(qū)的同源性 將雙向拼接的序列采用Mega5.05軟件排列，根據(jù)X區(qū)5’端和3’的標(biāo)志性序列進(jìn)行雙向外源序列剪切，剩余序列采用N-J法進(jìn)行聚類分析，從而了解各菌株間的遺傳關(guān)系。

1.11 Spa X區(qū)的穩(wěn)定性 隨機對5株燒傷科臨床分離金葡菌常規(guī)條件下培養(yǎng)，每24h傳代一次，共計20次。對原代菌及最后一次傳代菌的Spa X區(qū)PCR擴(kuò)增（參照步驟1.5和1.9）并測序分析，觀察spa X區(qū)核苷酸序列的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 金葡菌分離率 燒傷科2015年共計分離金葡菌72株，除開重復(fù)分離菌株，共計分離到67株。其中創(chuàng)面?zhèn)诜置谖?4株，血流11株，痰及其它12株，根據(jù)當(dāng)年燒傷科標(biāo)本送檢標(biāo)本總數(shù)為2761份，推斷出金葡菌檢出率為2.61%。

2.2 金葡菌耐藥情況 2015年共計分離到67株金葡菌，其中MRSA64株，MSSA3株。67株菌株對青霉素耐藥，四環(huán)素、紅霉素和克林霉素耐藥率分別為70.31%、74.63%和62.69%株；慶大霉素和利福平耐藥率為59.70%；環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和莫西沙星耐藥率分別為17.91%、14.92%和8.96%。11株菌對復(fù)方新諾明及3株菌對喹努普叮/達(dá)福普叮耐藥，未見萬古霉素和利奈唑胺耐藥株。

2.3 MecA基因檢測結(jié)果 67株菌中62株檢測到MecA基因，且表型篩查全部為陽性，兩者符合率為97.01%。

2.4 SCCmec分型結(jié)果 共計62株MecA菌中，Ⅰ型4株；Ⅱ型19株；Ⅲ型27株；Ⅳ型8株；Ⅴ型1株；3株未分出型別。

2.5 毒力因子檢測結(jié)果 67株菌中，PVL陽性12株，Nuc 67株，Coa 64株，其中MRSA的PVL陽性11株，MSSA的PVL陽性1株。

2.6 Spa分型結(jié)果 67株金葡菌共計含有10個基因型，以 t030為主，占總數(shù)的 31.34%（21/67）；t062 17株，占總數(shù)的25.37%；t002 10株，占總數(shù)的14.92%；t127 6株，其中包括t6418 4株；t037 3株；其它少見型別6株。

2.7 核苷酸多態(tài)性分析 首先應(yīng)用Mega5.05軟件對67株金葡菌進(jìn)行序列排列，剪除X區(qū)外的前后端測序不完全序列，采用N-J法進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果見圖2。67株菌共分成6個簇，其中簇1至簇 6分別有 29、8、10、2、7及 10株菌。 進(jìn)一步觀察簇別和spa分型結(jié)果的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)t030主要在C1、t127在C2、t002在 C3和 t062在C5中。

2.8 5株臨床菌株經(jīng)20d20代傳代培養(yǎng)，測序比較前后序列，發(fā)現(xiàn)spaX區(qū)沒有任何SNP改變。

3 討論

本研究分離的67株菌中，頭孢西丁表型篩查檢測到64株MRSA，表明燒傷科MRSA檢出率高（95.52%，64/67），雖然mecA基因檢測是判斷菌株是否為MRSA的金標(biāo)準(zhǔn)，然而由于mecA基因存在異質(zhì)性改變[8]，故通常不能僅以檢測到mecA基因來判斷是否為MRSA。本研究中，2株MRSA的頭孢西丁表型篩查為陽性，但沒檢測到mecA基因，是否為該原因值得探討。67株菌全對青霉素耐藥，表明所有分離菌株都產(chǎn)生了β-內(nèi)酰胺酶，紅霉素、四環(huán)素、林可霉素、慶大霉素和利福平的耐藥率接近或超過60%，則這些藥物不能常規(guī)經(jīng)驗性用于我院燒傷科患者的治療。三種代表性的氟喹諾酮類藥物耐藥率都低于20%，，故氟喹諾酮類藥可經(jīng)驗性用于治療金葡菌的感染。復(fù)方新諾明和喹努普叮/達(dá)福普叮的耐藥率低，輕度感染時可考慮。嚴(yán)重性感染時，美國感染性疾病協(xié)會（IDSA）推薦使用萬古霉素和利奈唑胺治療[9]。

流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，MRSA亞型Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ共計分離到50株，約占總數(shù)的74.6%，表明燒傷科金葡菌感染株主要為醫(yī)院獲得性[10]。另外，本研究中共計9株MRSA菌為Ⅳ或Ⅴ型，且這些株菌都含有PVL基因，而該毒力因子常為社區(qū)獲得性感染菌株的標(biāo)識之一，表明燒傷患者存在社區(qū)獲得性MRSA感染。

Spa測序分型研究發(fā)現(xiàn)，該院燒傷病區(qū)主要流行株為t030型，這與國內(nèi)某些研究一致[11]。次要流行株為t062型，該型別菌常引起社區(qū)獲得性感染，最早于2003年在德國被發(fā)現(xiàn)，隨后該菌株在法國、比利時等西方國家被發(fā)現(xiàn)，近年來，該菌型在發(fā)現(xiàn)，例如浙江地區(qū)[12]。t002為全球彌散性播散菌株，目前從5大洲都被分離到，占總數(shù)的6.9%，本燒傷病區(qū)的分離率14.92%，高于全球平均水平。為了進(jìn)一步了解分離菌株間的遺傳關(guān)系，我們選擇金葡菌A蛋白（spa）基因的X區(qū)進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）分析。研究結(jié)果表明：該基因區(qū)具有較好的位點穩(wěn)定性，與Frénay等的研究結(jié)果[12]一致。此外，部分菌株具有完全相同的序列，故在短時間內(nèi)認(rèn)為這些菌株具有流行病學(xué)聯(lián)系。例如6月中旬從燒傷ICU病區(qū)2d內(nèi)分離的3株MRSA和4月初同一病區(qū)1株MRSA具有完全相同的X區(qū)序列，表明該型菌株導(dǎo)致了燒傷病區(qū)的院內(nèi)感染。雖然有研究認(rèn)為單采用X區(qū)進(jìn)行重復(fù)序列的大小及數(shù)目多少的研究的分辨率甚至好于MLST和PFGE分型技術(shù)[13，14]。由于不具有流行病學(xué)聯(lián)系的菌株也可有相同的spa分型結(jié)果，故對于近期感染傳播不能單獨依靠spa分型結(jié)果來建立。本研究發(fā)現(xiàn)，即使具有相同spa型別的菌株由于存在基因堿基的點突變，即spaX區(qū)的分型結(jié)果相同，但聚類分析所獲得的SNP結(jié)果不同，這也從具有相同spa分型結(jié)果的菌株但并不屬于同一簇的結(jié)果也證明了這點。我們通過分析spaX區(qū)的序列，成功地建立了6組18人的院內(nèi)感染聯(lián)系，具有感染聯(lián)系的患者不旦SCCmec和spa分型結(jié)果相同且Nuc和Coa的部分基因測序結(jié)果也完全相同，雖然部分患者并不來源于同一病房，是否這些患者是由于中間環(huán)節(jié)傳播而具有感染聯(lián)系，需要進(jìn)一步研究。