高雅芬 馬 駿

近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)在心肌缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion，I/R)中起到有害作用。其一旦被激活，配體信號(hào)可以通過(guò)分別導(dǎo)致NF-κB和IRF-3/7活化的MyD88依賴(lài)和MyD88非依賴(lài)途徑發(fā)生轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且隨后刺激前炎癥和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子基因表達(dá)。細(xì)胞因子釋放有助于中性粒細(xì)胞激活、募集、粘附和滲透到心臟損傷部位，進(jìn)一步延續(xù)炎癥過(guò)程和細(xì)胞凋亡。本文針對(duì)TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及其在心肌缺血再灌注損傷及心肌保護(hù)中的作用研究進(jìn)展綜述如下。

1.TLR4的基本結(jié)構(gòu)與配體

(1)TLR4的基本結(jié)構(gòu) 1985年TLRs(Toll-like receptors，TLRs)因其在果蠅胚胎發(fā)育作用的研究首次被發(fā)現(xiàn)，后來(lái)被證實(shí)其在固有免疫中發(fā)揮著重要作用。目前已知，在人類(lèi)細(xì)胞中存在10種TLRs，其中6種位于細(xì)胞表面并可被多種外源、內(nèi)源性配體激活(TLR1，TLR2，TLR4，TLR5，TLR6和TLR10)，4種在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(TLR3，TLR7，TLR8和TLR9)，通常被核酸結(jié)構(gòu)識(shí)別[1]。TLR在各種類(lèi)型的細(xì)胞中表達(dá)，包括心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。人類(lèi)TLR4是第一個(gè)被表征的哺乳動(dòng)物Toll蛋白，人類(lèi)心臟中TLR信使RNA的相對(duì)表達(dá)水平從TLR4、TLR2、TLR3、TLR5、TLR1、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10依次遞減。TLRs是I型跨膜蛋白，由胞膜外區(qū)、胞漿區(qū)和跨膜區(qū)三部分組成，包括作為配體識(shí)別結(jié)構(gòu)域的胞外C末端、中心跨膜結(jié)構(gòu)域和類(lèi)似于IL-1受體的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。TLRs的胞外域由20-30個(gè)氨基酸組成，富含亮氨酸(L)，包括共有序列LxxLxLxxN。TLR4通常形成同二聚體來(lái)識(shí)別配體，隨后通過(guò)促進(jìn)其下游銜接子的募集來(lái)啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)。

(2)TLR4配體 TLR4識(shí)別的配體分為外源性配體和內(nèi)源性配體兩大類(lèi)。外源性配體主要為病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，如脂多糖，磷壁酸，肽聚糖，甘露糖和葡聚糖等，較常發(fā)生在機(jī)體對(duì)外界感染因素所產(chǎn)生的固有免疫過(guò)程中。在心肌I/R中，壞死心肌細(xì)胞產(chǎn)生的“危險(xiǎn)信號(hào)”也可以激活免疫應(yīng)答。因此，稱(chēng)為損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)，作為內(nèi)源性配體被TLR識(shí)別。近年來(lái)研究已證實(shí)，心肌I/R過(guò)程中可產(chǎn)生多種DAMPs激活TLR4，例如壞死心肌產(chǎn)生的熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)和高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)，I/R導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)成分發(fā)生改變，如纖維蛋白原、硫酸乙酰肝素、S100蛋白等[2]。此外，也有研究認(rèn)為I/R中產(chǎn)生的活性氧及受體-質(zhì)膜的物理改變同樣能產(chǎn)生內(nèi)源性DMAPs激活TLR4[3]。

TLR4識(shí)別配體的機(jī)制之一依賴(lài)于不同TLRs不同的胞外域殘基。位于TLR胞外區(qū)氨基酸序列變異導(dǎo)致結(jié)構(gòu)構(gòu)象的變化，以識(shí)別不同的配體。此外，輔因子還可以反映TLR配體組成的多樣性。TLR4形成同源二聚體結(jié)合輔因子，例如CD14，髓樣分化蛋白2和脂多糖結(jié)合蛋白，進(jìn)一步遞送特定的分子，同時(shí)避免其他配體，確保DAMPs的正確檢測(cè)。TLR4在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行加工折疊時(shí)，輔因子也產(chǎn)生了重要的作用，確保TLR4可以到達(dá)指定的亞細(xì)胞區(qū)室，與配體結(jié)合并啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

2.TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路

(1)MyD88依賴(lài)通路 MyD88依賴(lài)通路是在TLR4激活后通過(guò)髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)啟動(dòng)的。MyD88是含Toll /IL-1受體(Toll/interleukin-1 receptor，TIR)結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白，其羧基端連接活化后TLR4的胞內(nèi)TIR樣區(qū)，氨基端結(jié)合IL-1受體相關(guān)激酶4(IL-1 receptor associated kinase 4，IRAK4)，并激活其他IRAK家庭成員之一，IRAK1或IRAK2[4]。通過(guò)與磷酸化的IRAK1締合募集TNF受體相關(guān)因子-6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)并將其磷酸化。此后，磷酸化的TRAF6從受體解離并與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激酶1(Transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1)，TAK1結(jié)合蛋白-1(TAK1-binding protein 1，TAB1)和TAB2形成復(fù)合物。該復(fù)合物結(jié)合泛素連接酶從而激活I(lǐng)KKα/IKKβ/IKKγ，并誘導(dǎo)IκB磷酸化。磷酸化IκB從復(fù)合物解離，并直接泛素化和蛋白酶體降解，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB被激活釋放。除了激活I(lǐng)KK復(fù)合物，TAK1還可以激活促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路，如ERK通路，JNK通路和p38通路。MAPK信號(hào)通路可以激活轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(AP-1)。NF-κB和AP-1的活化有助于促炎細(xì)胞因子如IL-6，IL-1和TNF-α的表達(dá)。

(2)MyD88非依賴(lài)途徑 TLR4還可以通過(guò)MyD88非依賴(lài)途徑進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，亦稱(chēng)TRIF依賴(lài)途徑。由含TIR樣結(jié)構(gòu)的接頭蛋白TRIF(TIR domain-containing adapter-inducing interferon，TRIF)和TRIF相關(guān)適配子(TRIF-related adapter molecule，TRAM)啟動(dòng)，可以導(dǎo)致干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory，IRF)和NF-κB兩者的激活和隨后的干擾素(interferon，IFN)和促炎細(xì)胞因子表達(dá)。

TRAM和TRIF啟動(dòng)后，可與TRAF相關(guān)NF-κB激酶1(TBK1)和IKK-ε相互作用，使IRF3磷酸化。TRIF還可以與IRAK1和IKK-ε相互作用，用于激活I(lǐng)RF7?；罨腎RF3/7轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與DNA結(jié)合，并產(chǎn)生如IFN-β的抗病毒分子。在MyD88非依賴(lài)途徑中，TRIF也能激活NF-κB。類(lèi)似于MyD88依賴(lài)途徑，TRIF可募集TRAF6和TAK1，通過(guò)泛素依賴(lài)機(jī)制激活NF-κB和MAPK。此外，TRIF也能直接通過(guò)募集受體相關(guān)作用蛋白1(receptor interacting protein 1，RIP1)激活NF-κB。因此，TRIF既能通過(guò)與TBK1和IRAK1相互作用激活I(lǐng)RF，也能通過(guò)招募TRAF和與RIP1相互作用激活NF-κB，RIP1能與fas相關(guān)死亡蛋白相互作用，觸發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3.TLR4與心肌缺血再灌注損傷

近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，TLR除了在防御病原體入侵的宿主免疫中發(fā)揮著重要作用，其固有免疫的激活也參與I/R的急性炎癥反應(yīng)。當(dāng)從受損心肌細(xì)胞釋放的“危險(xiǎn)”信號(hào)(DAMPs)與模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRR)相互作用時(shí)，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。Frantz等首次在梗死心肌的重構(gòu)組織中發(fā)現(xiàn)了TLR4表達(dá)的增強(qiáng)[5]。Vilahur G等在豬的閉合性冠狀動(dòng)脈閉塞模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了與TLR4-MyD88-NF-κB通路和TRIF依賴(lài)通路相關(guān)的促炎癥因子和抗病毒分子水平均升高[6]。

(1)TLR4信號(hào)通路與心肌再灌注損傷中的有害作用 Oyama 等首次報(bào)告了TLR4在小鼠心肌I / R損傷中的有害作用。與野生型小鼠相比，TLR4缺陷型小鼠可減少心臟炎癥反應(yīng)和縮小心肌梗死面積[7]。近年來(lái)，Louwe等發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性TLR4抑制劑RP105的缺乏可導(dǎo)致炎性狀態(tài)增強(qiáng)，并且在誘導(dǎo)心肌梗死后心臟擴(kuò)張更顯著，強(qiáng)調(diào)了TLR4信號(hào)途徑在心肌梗死后對(duì)心肌重構(gòu)的作用[8]。而RP105的過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致TLR4，P38-MAPK和AP-1信號(hào)傳導(dǎo)途徑的失活，抑制隨后產(chǎn)生的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而減輕心肌I/R[9]。也有研究表明，心肌缺血損傷后，硫酸乙酰肝素可以通過(guò)TLR4/NF-κB，PI3K / AKT途徑增加細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)和血管細(xì)胞黏附分子(VCAM-1)的表達(dá)，這有利于脾臟單核細(xì)胞和骨髓粒細(xì)胞與心臟成纖維細(xì)胞粘附，觸發(fā)心肌成纖維細(xì)胞分化為心肌纖維細(xì)胞形成瘢痕[10]。然而，對(duì)于I/R后心臟功能的恢復(fù)，研究結(jié)果不一致，Kim等表明TLR4缺陷小鼠在I/R后，其血清細(xì)胞因子水平降低和心肌梗死面積減小，但是心臟功能并未恢復(fù)[11]，F(xiàn)allach等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果則相反[12]。

心肌I/R引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，涉及多形核嗜中性粒細(xì)胞的滲透、活性氧的生成以及活化補(bǔ)體的形成[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠心臟I/R模型中，在再灌注過(guò)程中輸注中性粒細(xì)胞，心肌細(xì)胞TLR4缺陷的心臟中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)更少，然而，輸注TLR4缺陷型中性粒細(xì)胞，不影響心臟中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)[14]，提示心肌細(xì)胞TLR4是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)所需要的。另外一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞TLR4也參與心肌細(xì)胞損傷，丹參多酚酸鹽可能通過(guò)抑制單核細(xì)胞Toll受體4的環(huán)節(jié)來(lái)降低單核細(xì)胞黏附分子的表達(dá)和黏附能力，進(jìn)而減輕心肌損傷[15]。Hally KE等人還發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗塞的患者中血小板TLR4數(shù)量顯著上調(diào)[16]。不同細(xì)胞TLR4的分布和激活在I/R中心肌損傷的作用尚需進(jìn)一步探討。ROS生成除了由中性粒細(xì)胞激活釋放外，還可能通過(guò)激活TLR4上調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS2)和環(huán)氧化酶的表達(dá)，增加ROS的產(chǎn)生。缺血再灌注后期TLRs水平及炎癥因子表達(dá)水平再次升高，可能損傷心肌結(jié)構(gòu)和功能，其分子機(jī)制可能與凋亡(Bcl2、Bax、p53、活性caspase-3)， TLR4-MyD88依賴(lài)途徑、TRIF途徑，Akt-mTOR-P70S6K軸激活和纖維化(TGF-β，膠原蛋白A1 / A3)相關(guān)。此外，有研究表明巨噬細(xì)胞清道夫受體A類(lèi)(SR-A)是TLR4的輔助受體，以促進(jìn)炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞存活和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。

另有研究發(fā)現(xiàn)，與心肌I / R損傷后的野生型小鼠相比，TLR4缺陷小鼠的心肌中活化Akt的水平顯著增加，表明TLR4-MyD88-NF-κB通路和PI3K-Akt信號(hào)通路之間存在相互調(diào)節(jié)[18]。推測(cè)PI3K-Akt信號(hào)通路的激活可能是TLR4缺陷小鼠心肌保護(hù)機(jī)制的反應(yīng)，PI3K-Akt信號(hào)通路可最終作用于線(xiàn)粒體和K+通道，減少mPTP開(kāi)放和增加K+通道開(kāi)放來(lái)實(shí)現(xiàn)心肌保護(hù)作用。

(2)TLR4信號(hào)通路與心肌再灌注損傷中的心肌保護(hù) 許多研究已經(jīng)提出，抑制TLR4信號(hào)通路可以減弱炎癥反應(yīng)和心肌I/R導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[19-22]。另一種新型TLR4拮抗劑異丁司特(Ibudilast)被發(fā)現(xiàn)可以抑制促炎細(xì)胞因子，如TNF和IL-6的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中抗炎細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生[23]。但也有研究表明，I/R后應(yīng)用祖細(xì)胞治療時(shí)，其遷移可能依賴(lài)于TLR信號(hào)傳導(dǎo)，TLR4信號(hào)傳導(dǎo)的治療性阻斷可能會(huì)干擾心肌細(xì)胞的再生[24]。TLR4或其下游基因的一些配體如脂多糖(LPS)、磷酸葡聚糖(GP)、HMGB1等可以用作預(yù)處理誘導(dǎo)劑，增強(qiáng)對(duì)心肌I / R損傷的心肌保護(hù)。LPS預(yù)處理的心肌保護(hù)作用在TLR4(-/-)或MyD88(-/-)心肌細(xì)胞中并不能體現(xiàn)。此外，使用NOS2抑制劑后消除了LPS處理增強(qiáng)心肌細(xì)胞存活和功能恢復(fù)的作用。說(shuō)明MyD88，TLR4，NOS2參與了LPS配體介導(dǎo)的心肌保護(hù)[25]。在大鼠I/R模型中，發(fā)現(xiàn)用GP預(yù)處理可減少大鼠心肌再灌注后的梗死面積，其機(jī)制涉及減少TLR4與MyD88的結(jié)合，抑制I / R誘導(dǎo)的IRAK和IKKβ活性以及降低NF-κB活性。此外，GP增加TLR4酪氨酸磷酸化，導(dǎo)致心肌中PI3K-Akt活性增加，這與I/R后心肌細(xì)胞凋亡減少相關(guān)。同樣，亞劑量的HMGB1可以誘導(dǎo)心肌I/R保護(hù)，而當(dāng)PI3K-Akt藥物拮抗劑LY294002與HMGB1聯(lián)合給藥時(shí)，預(yù)處理效果被廢除[26]。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明在心肌I/ R損傷期間TLR4-MyD88-NF-κB通路和PI3K-Akt信號(hào)通路之間存在相互調(diào)節(jié)。值得注意的是，LPS預(yù)處理誘導(dǎo)心肌保護(hù)時(shí)，至少需要在心肌缺血前8h接受預(yù)處理，而GP預(yù)處理在心肌缺血前1h和缺血發(fā)生后5分鐘內(nèi)就可以通過(guò)相關(guān)機(jī)制產(chǎn)生心肌保護(hù)。這表明GP的心肌保護(hù)機(jī)制與LPS不同。這些實(shí)驗(yàn)也表明TLR4及其下游基因可能是潛在的治療靶點(diǎn)，用這些分子預(yù)處理可以降低與心肌I/R相關(guān)的發(fā)病率和病死率。

HSP60作為T(mén)LR4內(nèi)源性DAMPs的一種，激活TLR時(shí)與LPS、GP預(yù)處理產(chǎn)生心肌保護(hù)的作用卻恰恰相反。在小鼠心肌I/R模型中，內(nèi)源性產(chǎn)生的HSP60通過(guò)TLR4-MyD88-p38/NF-κB通路誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生，并通過(guò)TLR4-MyD88-JNK/NF-κB通路上調(diào)TLR4的表達(dá)，最終引起心肌炎癥[27]。同樣，外源性的重組HSP60通過(guò)心肌細(xì)胞中的TLR4誘導(dǎo)凋亡。TLR4信號(hào)由LPS或易位HSP60激活導(dǎo)致細(xì)胞分別存活和凋亡的機(jī)制尚不清楚，可能與TLR4識(shí)別配體時(shí)參與的特異輔因子的不同有關(guān)。由此可見(jiàn)，TLR4在應(yīng)答非感染性損傷時(shí)，在介導(dǎo)組織炎癥和細(xì)胞存活中發(fā)揮著廣泛的作用。

4.總結(jié) 大量證據(jù)表明，TLR4通過(guò)MyD88依賴(lài)途徑增強(qiáng)許多促炎基因表達(dá)，從而加重心肌損傷。抑制TLR4信號(hào)通路是心肌炎癥的緩解方法，然而對(duì)心臟功能恢復(fù)的保護(hù)作用仍然有質(zhì)疑。直接抑制TLR4可能導(dǎo)致其固有的免疫機(jī)制功能喪失，TLR4在心肌內(nèi)同時(shí)參與宿主免疫和組織修復(fù)過(guò)程， TLR4可以激活MyD88非依賴(lài)途徑，并進(jìn)一步促進(jìn)IFN-β表達(dá)，對(duì)心肌炎癥產(chǎn)生有益作用。

此外，靶向TLR4信號(hào)通路的預(yù)處理可以有效地減輕心肌I/R。一些其他信號(hào)傳導(dǎo)途徑可以與TLR4信號(hào)傳導(dǎo)途徑相互調(diào)節(jié)，并對(duì)心肌炎癥發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。例如PI3K-Akt信號(hào)通路參與心肌I/R過(guò)程中的心肌保護(hù)，并且減少TLR4缺陷小鼠不良的心肌重塑。在調(diào)節(jié)TLR4信號(hào)傳導(dǎo)期間是否可減少心肌炎癥的同時(shí)保證免疫的優(yōu)勢(shì)是需要進(jìn)一步研究的重要問(wèn)題。