秦 爽 劉 紅 劉稱稱 陳天杰 路政寬 黃 山

作者單位：130021長春，吉林大學(xué)口腔醫(yī)院·吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點實驗室（劉紅為通訊作者）

淫羊藿（epimedium）別名仙靈脾、三枝九葉等，為小檗柴科多年生植物，作為中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的一種補腎溫陽藥被廣泛應(yīng)用。淫羊藿苷（icariin，ICA）是淫羊藿中含量最為豐富的黃酮類化合物，可從淫羊藿屬植物的干燥莖葉中提取，在心血管、內(nèi)分泌、支氣管、泌尿和免疫系統(tǒng)中有廣泛的應(yīng)用，同時還具有抗腫瘤、抗肝毒、抗缺氧等作用。大量研究證實，淫羊藿苷的骨代謝調(diào)控作用主要表現(xiàn)為促進骨形成和抑制骨吸收，在促進成骨時，可經(jīng)相關(guān)成骨信號通路誘導(dǎo)干細胞成骨分化，并且能提高成骨細胞的活性，增加骨強度，提高骨質(zhì)量；淫羊藿苷抑制破骨細胞分化主要是通過OPG/RANK/RANKL通路實現(xiàn)的，同時還可降低破骨細胞活性。淫羊藿苷在成骨破骨兩方面協(xié)同作用，使成骨—破骨體系向著成骨方向進行。ICA在國內(nèi)來源廣泛、價格低廉，又因其綜合成骨率高，臨床治療時可很大程度上避免傳統(tǒng)骨修復(fù)的免疫排斥、機體耐受等問題，使ICA在骨組織工程研究中的應(yīng)用越來越廣泛，成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點，越來越多的學(xué)者報道了ICA影響干細胞、成骨細胞和破骨細胞的增殖、分化和礦化等。為了方便ICA更好的應(yīng)用于臨床，研究ICA的藥物作用機理也就顯得格外重要，本文就近幾年國內(nèi)外學(xué)者們的研究成果做了以下詳述。

一、淫羊藿苷對骨形成的影響及機制

1.淫羊藿苷對干細胞成骨性分化的影響

骨髓間充質(zhì)細胞（BMSCs）成骨分化的過程受多種信號蛋白和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。有研究表明，ICA在無地塞米松誘導(dǎo)劑的條件下，通過上調(diào)Runx-2基因的表達，促進體外BMSCs的成骨分化[4]。其中Runx-2是調(diào)節(jié)BMSCs向成骨細胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，被視為成骨分化過程啟動的開關(guān)。鮑遠[5]等單獨用 10-6mol/L ICA培養(yǎng) BMSCs，結(jié)果顯示Runx-2、OCN、Osx等成骨分化相關(guān)基因的表達均比對照組明顯增加，有力的證明了ICA具有促進BMSCs成骨分化的作用。Wei等[6]在探究ICA對BMSCs成骨分化影響時，發(fā)現(xiàn)0.1μM的ICA可促進細胞成骨分化，且分化早期高水平表達Runx-2、β-catenin、OPN，分化晚期高水平表達OCN。這一發(fā)現(xiàn)極大地推進了骨組織工程的進展，以BMSCs為載體，以ICA為骨誘導(dǎo)因子的新興成骨技術(shù)有很高的臨床可行性，成為骨修復(fù)的潛在力量。在對ICA成骨作用的探索中，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)ICA不僅對BMSCs的成骨性分化有促進作用，在它干預(yù)下的其他干細胞成骨性分化功能亦可增強。秦子順等[7]系統(tǒng)的研究了ICA作為骨誘導(dǎo)因子對人牙周膜干細胞（hPDLSCs）成骨分化的影響，綜合體內(nèi)外實驗，發(fā)現(xiàn)實驗組ALP活性、鈣化結(jié)節(jié)面積、成骨基因的相對表達量升高，并且骨量較對照組也明顯增加，說明一定濃度的ICA可促進hPDLSCs的成骨分化。自2000年，人牙髓干細胞（hDPSCs）由Gronthos首次成功分離培養(yǎng)后，為了誘導(dǎo)hDPSCs生成成牙本質(zhì)細胞，并進一步形成牙本質(zhì)，國內(nèi)學(xué)者大膽嘗試，在體外，以10mol/L的ICA作用于hDPSCs后，明顯地促進了hDPSCs中各礦化相關(guān)基因的表達和礦化結(jié)節(jié)的形成。以大鼠牙髓干細胞為實驗對象，同樣也發(fā)現(xiàn)了ICA對其成骨分化具有促進作用[8，9]。另外，葉亞平等[10]發(fā)現(xiàn)ICA的干預(yù)可增加脂肪干細胞ALP的表達，且用2000μ應(yīng)力聯(lián)合10-7mol/L ICA對脂肪干細胞促成骨分化的作用最明顯。

2.淫羊藿苷對成骨細胞活性的影響

正常的骨代謝依賴于成骨—破骨系統(tǒng)的穩(wěn)定，其中成骨細胞在骨形成的過程中起著重要的作用。隨著ICA在治療骨質(zhì)疏松方面廣泛的應(yīng)用，學(xué)者們也開始更深入地探究ICA對成骨細胞的影響。Zhang等[11]曾報道ICA可通過上調(diào)成骨細胞特異性標記基因的表達促進原代成骨細胞分化，增加細胞外基質(zhì)的生成和礦化。Feng等[12]在體外構(gòu)建成骨細胞—破骨細胞共培養(yǎng)體系模擬骨代謝環(huán)境，以探究ICA在骨代謝中的作用，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)系統(tǒng)可降低MC3T3-E1細胞中OPG、ALP基因表達水平，但在加入一定濃度ICA后，二者表達均顯著恢復(fù)。姜文濤等[13]以小鼠MC3T3-E1細胞株為研究對象，發(fā)現(xiàn)一定濃度的ICA不僅可以促進成骨細胞早期分化和晚期礦化，還可以提高成骨細胞的增殖能力。

3.淫羊藿苷促進成骨相關(guān)信號通路

（1）BMPs/Smad 信號通路：BMPs家族屬于TGF-β超家族成員，是調(diào)節(jié)成骨細胞產(chǎn)生、增殖、分化的蛋白因子。Smad可分為受體調(diào)節(jié)型Smad，包括Smad1/2/3/5/8，其中Smad1/5/8由BMPs激活；共介質(zhì)型Smad，主要為Smad4，可與受體調(diào)節(jié)型Smad形成雜聚體，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；抑制型Smad，包括Smad6/7，可與磷酸化的Smad1/5/8生成無活性物質(zhì)，阻礙信號傳遞[14，16]。當信號傳遞至細胞核內(nèi)時，可與DNA連接蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)Runx-2和Osterix基因的轉(zhuǎn)錄。笪巍偉等[17]在研究ICA對成骨細胞增殖和分化的影響時，發(fā)現(xiàn)ICA可顯著提高前成骨細胞株OCT1細胞中的BMP-2 mRNA、Runx-2mRNA的表達量，并且通過激活BMPs/Smad信號通路誘導(dǎo)成骨細胞的增殖和分化。Liang等[18]以hFOB 1.19細胞為研究對象，探討ICA促進成骨分化的機制，發(fā)現(xiàn)經(jīng) ICA干預(yù)后的細胞的 BMP-2、Smad4、Runx-2的表達水平均有所上升，因而說明ICA可通過BMPs/Smad通路促進成骨分化和骨形成。

（2）Wnt信號通路：Wnt信號通路與細胞的增殖、分化和遷移息息相關(guān)，包括Wnt/β-catenin通路（Wnt經(jīng)典信號通路），Wnt細胞極性（PCP）通路和Wnt/鈣離子（Wnt/Ca2）通路，已有實驗證實ICA促進成骨可通過Wnt經(jīng)典通路實現(xiàn)。當細胞外的Wnt蛋白和細胞膜上的Fz、LRP5/6復(fù)合體結(jié)合后可激活細胞內(nèi)的散亂蛋白DVL，活化的DVL可抑制APC、Axin、GSK-3β復(fù)合體，從而解除了其對β-Catenin的降解作用，使細胞內(nèi)β-Catenin濃度上升，進入細胞核與轉(zhuǎn)錄因子（TCL/LEF）結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因（C-myc、Runx-2、OSX）表達[19]。Fu 等[20]在研究 ICA的藥理作用機制時發(fā)現(xiàn)0.05～2.0mg/L的ICA可明顯促進BMSCs增殖，并且檢測到實驗組β-Catenin mRNA的表達量、GSK-3β磷酸化水平、cyclinD1蛋白表達量均有所提高。Yang等[21]報道過在細胞培養(yǎng)過程中加入Wnt通路抑制劑DKK1后，ICA介導(dǎo)的Runx-2上調(diào)和使GSK-3β磷酸化的效應(yīng)有所減弱。此外，Wei等[22]也用ICA和Wnt通路抑制劑做過類似的探究，結(jié)果顯示一定濃度的ICA，尤其是0.1μM，可明顯促進BMSCs增殖，并且還能提高成骨相關(guān)基因和Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白的表達水平。而再加入Wnt通路抑制劑后，上述基因表達能力均下降。這些都說明了ICA誘導(dǎo)成骨依賴于Wnt信號通路，并且主要是激活Wnt經(jīng)典通路。

（3）MAPK信號通路：MAPK通路是由MAPK激酶激酶（MAP3K），MAPK激酶（MAP2K）和MAPK組成的三級酶促級聯(lián)反應(yīng)，根據(jù)MAP激酶亞族種類不同而分為四條主要途徑：ERK1/2通路、JNK通路、P38通路、ERK5/BMK1通路，各通路均能傳遞信號至細胞核，激活下游轉(zhuǎn)錄因子[23]。為了探究ICA是否以MAPK依賴的方式誘導(dǎo)BMSCs的增殖和分化，Qin等[24]先用ICA培養(yǎng)BMSCs，后分別加入ERK和P38特異性抑制劑，發(fā)現(xiàn)ICA可以明顯誘導(dǎo)BMSCs中ERK和P38激酶磷酸化，在加入抑制劑后，不僅這些激酶的活化受限，而且ICA誘導(dǎo)細胞增殖的能力也有所減弱。Wu等[25]將用ICA處理過的BMSCs在補充有ERK、JNK、P38信號通路抑制劑的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)7天，發(fā)現(xiàn)ALP活性和膠原蛋白I、OPN、OCN的表達能力均被抑制，這些結(jié)果表明ICA促進成骨大鼠BMSCs的分化時至少部分是通過激活ERK，P38和JNK信號通路完成的。

（4）PI3K-AKT-eNOS-NO-cGMP-PKG 信號通路：PI3K-AKT-eNOS-NO-cGMP-PKG信號通路是一個多級級聯(lián)反應(yīng)通路，其中內(nèi)皮型NOS（eNOS）可產(chǎn)生一氧化氮（NO），NO作為信號分子，可參與多種骨代謝活動。Zhai等[26]曾假設(shè)ICA的成骨活性與NO信號通路及其上游PI3K/AKT通路有關(guān)，在BMSCs培養(yǎng)基中加入ICA或ICA和PI3K、NOS、sGC、cGMP的抑制劑，一定時間后檢測該信號通路相關(guān)分子和成骨標志物的表達量，發(fā)現(xiàn)單獨的ICA處理組中上述檢測物質(zhì)含量均有不同程度的提高，而抑制劑處理組中的相關(guān)分子表達量則有不同程度的降低，很大程度上提示ICA的成骨作用涉及PI3K-AKT-eNOS-NO-cGMP-PKG信號通路。

（5）雌激素受體（ERs）介導(dǎo)的信號通路：雌激素受體（ER）是細胞內(nèi)受體家族，包括雌激素受體α（ERα）和雌激素受體β（ERβ），兩種受體均已被證實存在于成骨細胞、破骨細胞及其前體細胞中。在經(jīng)典通路中，雌激素受體可與ER直接結(jié)合而被激活，將信號傳遞至細胞核，隨后啟動下游靶基因轉(zhuǎn)錄，并控制成骨分化[27]。在研究ICA促進成骨分化的眾多實驗中，zhang等[28]發(fā)現(xiàn)0.1～10μM ICA在促進成骨的同時可上調(diào)ERα的表達，并在加入ER拮抗劑后，成骨相關(guān)基因Runx-2和BMP-2的表達受到了抑制。

綜上所述，ICA可以通過BMPs/Smad信號通路、Wnt信號通路、MAPK 信號通路、PI3K-AKT-eNOS-NO-cGMP-PKG信號通路、ERs介導(dǎo)的信號通路促進干細胞成骨性分化以及成骨細胞的增殖、分化和礦化。由于各通路錯中復(fù)雜，參與的因子眾多，所以各通路之間又互相影響，如BMP-2不僅可以激活BMPs/Smad通路，還可作用于MAPK通路，ERα又可介導(dǎo)Wnt/β-catenin通路，使ICA促進成骨時可同時依賴多條通路，增加了藥理機制研究的難度。

二、淫羊藿苷對骨吸收的影響及機制

骨是一種動態(tài)組織，由于體內(nèi)環(huán)境變化等因素不斷的破壞和重組，破骨細胞是骨組織中唯一介導(dǎo)骨吸收的細胞，在骨代謝平衡中發(fā)揮重要作用。破骨細胞的分化及其活性受多種激素和細胞因子的調(diào)節(jié)，其中RANK/RANKL是破骨細胞分化的重要通路之一。RANKL與前體破骨細胞及破骨細胞表面的跨膜受體蛋白RANK結(jié)合后，可以激活下游多條信號通路，進而調(diào)節(jié)破骨性分化和破骨細胞活性[29]。早有學(xué)者通過實驗發(fā)現(xiàn)，低濃度ICA抑制LPS誘導(dǎo)的RANKL上調(diào)和OPG下調(diào)的能力，從而抑制LPS誘導(dǎo)的破骨細胞發(fā)生，但對破骨細胞活性無影響[30]。何俊洲等[31]在此基礎(chǔ)上進行了分子層面的探索，發(fā)現(xiàn)ICA可濃度依賴性地抑制破骨細胞生成，其機理與抑制RANKL對c-fos和NFARcl等轉(zhuǎn)錄因子的誘導(dǎo)表達有關(guān)，而c-fos和NFATcl又是RANKL促進破骨細胞前體生成需要表達的產(chǎn)物。OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)位于ER介導(dǎo)的信號通路的下游，雌激素可通過ERα上調(diào)OPG表達，提高OPG對RANKL與RANK結(jié)合的競爭性，從而抑制破骨細胞的生成和活性。李偉娟等[32]發(fā)現(xiàn)ICA可促進破骨細胞的ERα mRNA表達，降低破骨細胞的RANK mRNA表達，而在ERα被阻斷后，檢測到破骨細胞數(shù)量增多以及RANK的含量升高。這些都表明ICA可抑制破骨細胞生成及破骨細胞活性，對抑制骨吸收具有重大研究意義。

三、淫羊藿苷成骨臨床應(yīng)用

目前，ICA的成骨作用在治療骨質(zhì)疏松方面應(yīng)用效果顯著。由淫羊藿等組成的骨松寶膠囊治療40例骨質(zhì)疏松患者的研究結(jié)果顯示，該藥可明顯提高骨密度，防止骨量丟失，改善骨質(zhì)疏松癥的臨床癥狀，總有效率高達100%[33]。對47例骨質(zhì)疏松患者應(yīng)用治痹補骨丹膠囊（由淫羊藿、補骨脂、功勞葉等組成）治療，3個月后平均骨礦含量增加8.01%，6個月后平均增加26.4%，骨密度水平恢復(fù)至正?；蚪咏＃f明該藥有效提高骨礦含量[34]。此外無名異沖劑、丹仙康骨膠囊、養(yǎng)骨天源膠囊、補腎健骨湯等含ICA的復(fù)方制劑在抑制骨量丟失、改善骨質(zhì)疏松癥狀等方面均表現(xiàn)出明顯的臨床療效。

四、小結(jié)

淫羊藿苷可以通過促進成骨分化、增強成骨細胞活性，同時抑制破骨細胞功能途徑滿足臨床治療相關(guān)要求，使ICA應(yīng)用不僅限于治療骨質(zhì)疏松，還可解決更多成骨相關(guān)問題，如曲美娟等[35]將ICA成骨作用與口腔種植相結(jié)合，在種植體表面加載ICA，使其促進種植體周圍形成新骨。尤其近年來在體內(nèi)外實驗中，高分子材料應(yīng)用成功的構(gòu)建了ICA緩釋系統(tǒng)，以維持藥物有效作用濃度，取得了顯著效果。

雖然國內(nèi)外學(xué)者對ICA成骨作用機制和臨床應(yīng)用的探究已積累了一定的成果，但其研究仍存在諸多問題，主要是由于ICA在體內(nèi)的有效活性成分結(jié)構(gòu)不明確，ICA常以口服途徑給藥，經(jīng)腸道細菌分解后產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，致使ICA發(fā)揮作用的形式不確定，無法研究其真正的作用機制；其次，目前對于ICA成骨作用的研究大多數(shù)停留在細胞水平，存在低重復(fù)率的現(xiàn)象，而在動物水平上的研究，仍需更廣泛的動物模型以獲得更完整的實驗數(shù)據(jù)；此外，ICA的藥理作用是由一個多系統(tǒng)共同參與的復(fù)雜過程，雖然對其機理已有了初步的掌握，但研究不夠深入，除了本文所提及的信號通路，還有其他信號通路，而且各信號通路之間交叉重疊、相互作用，僅針對獨立通路分子靶點的研究，具有很多的局限性，因此骨代謝信號通路之間的相互作用應(yīng)成為未來研究的熱點和重點之一，相信不久的將來，ICA可以成為臨床應(yīng)用中有效而價廉的新型藥物。