吳 越，許凱倫，黃振華，陸榮茂，姚青怡

(1.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江 溫州 325000； 2.寧波大學，浙江 寧波 315000)

南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)是我國主養(yǎng)對蝦品種，其養(yǎng)殖面積及養(yǎng)殖產(chǎn)量在國內(nèi)均占居主導地位。隨著對蝦養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，工廠化養(yǎng)殖模式快速興起，其中高位池精養(yǎng)模式由于其高密度、高產(chǎn)量、高效益的特點備受推崇。但在高位精養(yǎng)中由于過量投喂配合飼料、高密度對蝦自身代謝終產(chǎn)物積累以及藻相的異常變化等因素往往容易引起水質(zhì)敗壞，而亞硝酸鹽含量居高不下是養(yǎng)殖過程中經(jīng)常碰到的棘手問題之一。亞硝酸鹽是氨轉(zhuǎn)化成硝酸鹽過程中的中間產(chǎn)物，是養(yǎng)殖水體中主要的污染物之一。甲殼類動物對亞硝酸鹽毒性更為敏感，亞硝酸鹽脅迫會引起蝦體組織病變，抗病有關(guān)酶活力顯著下降，抗病能力減弱，嚴重影響對蝦的健康生長并制約著養(yǎng)殖產(chǎn)量的提高[1-3]?？刂扑w中亞硝酸鹽污染已成為集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖成功的關(guān)鍵措施之一。在水產(chǎn)養(yǎng)殖實踐中積累了一些物理和化學方法去除亞硝酸鹽，如物理吸附法、還原法、氧化法和間接控制法等，但這些方法往往只能暫時緩解和控制亞硝酸鹽含量高的情況，其作用時間短且亞硝酸鹽濃度易反彈，不適于規(guī)?；?、高密度養(yǎng)殖模式[4]。近年來，使用微生態(tài)制劑調(diào)控水質(zhì)作為一種綠色環(huán)保的養(yǎng)殖環(huán)境生物治理方法受到廣泛關(guān)注[5]。微生態(tài)制劑防治亞硝酸鹽污染中最為重要的是選擇合適高效的降解菌株。不同來源的菌種適應(yīng)性不同，有益微生物制劑在不同地區(qū)的效果也不同[6]。目前已經(jīng)開展了一些關(guān)于亞硝酸鹽去除菌的篩選工作，但對適用于南美白對蝦高位精養(yǎng)池的亞硝酸鹽去除菌的研究仍然較少。本研究以南美白對蝦高位精養(yǎng)池養(yǎng)殖后期的自然水體為材料，通過菌株富集、分離、純化、鑒定和環(huán)境因子單因素試驗，旨在尋找適用于高位精養(yǎng)池模式的亞硝酸鹽高效降解菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

用于分離細菌的水樣于2016 年 7 月16日取自位于浙江省溫州市龍灣區(qū)的浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所永興基地南美白對蝦高位精養(yǎng)池。用采水器在水深約50 cm 處采集水樣，樣品立即運回實驗室用于后繼試驗。試驗中使用的自然海水也來自永興基地，配置培養(yǎng)基的試劑購買自溫州市鹿城金山化學試劑儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集、分離和純化

首先對采集的水樣進行富集處理。本研究的富集培養(yǎng)基參考并改進侯穎等[7]報道富集培養(yǎng)基制備，具體成分為葡萄糖5.0 g，NaNO21.0 g，(NH4)2SO42.0 g， KNO31.0 g，抽濾自然海水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.5。121 ℃下高壓蒸汽滅菌 15 min 后用于去除亞硝酸鹽菌株的富集。

為富集亞硝酸鹽去除菌株，取采集水樣10 mL加入到100 mL富集培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min-1條件下震蕩培養(yǎng)24 h后，向培養(yǎng)基中再加入10 mL新鮮富集培養(yǎng)基強化富集效果。如此強化富集3次以淘汰對亞硝酸鹽耐受性差的菌株。隨后取10-1、10-2、10-3、10-4和10-5等5個稀釋度的富集培養(yǎng)液各100 μL 分別涂布到分離培養(yǎng)基上(分離培養(yǎng)基為富集培養(yǎng)基中加1.5%的瓊脂制成)，30 ℃培養(yǎng)直至長出明顯菌落。選取形態(tài)、顏色不同的單個菌落在分離培養(yǎng)基上多次畫線分離，直至無雜菌出現(xiàn)。最后將篩選出的純化菌株在斜面2216E瓊脂培養(yǎng)基上畫線保種。

1.2.2 菌種的篩選

將上述分離得到的菌株接種到 2216E液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min-1震蕩培養(yǎng) 24 h，以1∶50的比例接種至滅菌的篩選培養(yǎng)基，于30 ℃恒溫箱中培養(yǎng) 48 h。篩選培養(yǎng)基參考郭靜等[8]報道，具體成分葡萄糖1.0 g，NaNO327.5 mg，(NH4)2SO46.25 mg，KNO33.0 mg，抽濾養(yǎng)殖海水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.5，篩選培養(yǎng)基中亞硝酸鹽含量約2 mg·L-1。48 h后培養(yǎng)基用0.22 μm針式濾器過濾，用Seal AA3流動分析儀測定接種培養(yǎng)基中亞硝酸鹽含量，以未接種菌液培養(yǎng)基中亞硝酸鹽濃度為對照，每個菌株篩選培養(yǎng)重復(fù)3次，計算平均值用于比較各菌株的亞硝酸鹽去除率。

亞硝酸鹽去除率=(未接種篩選培養(yǎng)基亞硝酸鹽濃度-接種菌篩選培養(yǎng)基亞硝酸鹽濃度)/未接種菌篩選培養(yǎng)基亞硝酸鹽濃度×100。

1.2.3 篩選菌株的鑒定

篩選菌株的種類鑒定綜合采用形態(tài)學特征、16S rRNA測序及生理生化相關(guān)特征3個方面進行。

菌株的形態(tài)學特征觀察。將篩選菌株涂布到2216E瓊脂培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)，待長出菌落后進行革蘭氏染色并觀察菌落形狀、顏色、透明度等特征。

16S rRNA測序。培養(yǎng)后菌液基因組DNA采用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的細菌基因組DNA提取試劑盒抽提。DNA送生工生物工程(上海)股份有限公司進行16S rRNA測序。測序結(jié)果在GenBank上進行BLAST比對。

菌株生化特征鑒定。菌株的生理生化特征檢測方法通過檢索《伯杰氏細菌鑒定手冊》[9]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]進行。本研究用于生理生化特征檢測的指標見表1。

1.2.4 菌株生長測定

采用光電比濁法測定菌株生長曲線[11]。將菌株按1∶50接種至50 mL 2216E液體培養(yǎng)基，30 ℃、180 r·min-1震蕩培養(yǎng)，分別在 0、6、12、24、48和72 h 取樣3 mL，測定600 nm波長下菌液的吸光度值(D600 nm)，繪制菌株生長曲線。

1.2.5 環(huán)境因子對菌株亞硝酸鹽去除能力影響

本研究設(shè)置的pH值梯度為7.0、7.5、8.0、8.5(溫度為30 ℃，鹽度為2.5%)；鹽度梯度為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%(溫度為30 ℃，pH值為7.5)；溫度梯度為20、25、30、35 ℃(pH值為7.5，鹽度為2.5%)。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌液以1∶50接種到篩選培養(yǎng)基中，除用于比較的單一因子不同外，其他培養(yǎng)條件均保持一致。所有試驗處理均培養(yǎng)48 h 后取樣過濾，測定培養(yǎng)基中亞硝酸鹽濃度，分別計算菌株在不同溫度、鹽度和pH值培養(yǎng)條件下亞硝酸鹽去除率。每個處理組設(shè)3個平行。數(shù)據(jù)用Excel 2010和SPSS進行計算、分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離及篩選

對蝦養(yǎng)殖塘水體經(jīng)過富集和分離共得到56株細菌。經(jīng)過篩選培養(yǎng)測定亞硝酸鹽去除率獲得3株可去除亞硝酸鹽的菌株，分別編號為N3、N29和N38，其中N29去除率最高，達到90%以上，因此選擇N29做后續(xù)的研究。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 細菌16S rRNA序列

將N29的16S rRNA測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，結(jié)果顯示，N29的16S rRNA的序列和地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、索諾拉沙漠芽孢桿菌(Bacillussonorensis)、空氣芽孢桿菌(Bacillusaerius)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等有99% 的相似性(圖1)。16S rRNA 基因序列分析可以確定該菌屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，但無法確定具體是何種芽孢桿菌。

圖1 N29菌株16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.2 細菌生化特征

N29在2216E培養(yǎng)基上為白色不透明、扁平、邊緣不光滑菌落，革蘭氏染色結(jié)果顯示為陽性菌。共進行14項生理生化指標檢測，其中12項為陽性，2項為陰性，鑒定結(jié)果表明其生理生化特征與芽孢桿菌屬的地衣芽孢桿菌相符(表1)。

表1 N29菌株的生理生化特征

2.3 菌株生長

采用光電比濁法繪制了菌株N29的部分生長曲線，包括延滯期、指數(shù)期和平穩(wěn)期(圖2)。結(jié)果顯示，N29菌株在培養(yǎng)初期6 h內(nèi)生長較緩慢為延滯期，之后菌液濃度開始急速上升，可視為進入指數(shù)生長期。至36 h為止N29菌株一直處于快速生長階段，之后生長速度減慢，開始進入平穩(wěn)期。N29菌株的生長曲線基本呈現(xiàn)“S”型，與細菌的典型生長曲線相似。

圖2 N29菌株的生長曲線

2.4 菌株去除亞硝酸鹽能力

pH值梯度試驗結(jié)果顯示，菌株N29培養(yǎng)24 h后，在pH值為7.0～7.5時亞硝酸鹽去除率受pH值的影響較小，當pH值繼續(xù)上升時，其去除亞硝酸鹽能力呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(P<0.05)，在pH值為7.5時，亞硝酸鹽去除率最高為59.9%(圖3)。菌株N29在培養(yǎng)48 h后，亞硝酸鹽去除能力隨著pH值呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在pH值為7.5時最高達96.4%，顯著高于pH值為7.0和8.5時去除率，但與pH值為8.0時差異不顯著。pH值梯度試驗結(jié)果表明，N29去除亞硝酸鹽適宜pH值為7.5，但在pH值7.0～8.5其去除率均能達到90%以上。

圖3 pH值對亞硝酸鹽去除能力的影響

鹽度梯度試驗結(jié)果顯示，菌株N29培養(yǎng)24 h，其亞硝酸鹽去除率先隨著鹽度的上升而提高，至鹽度為2.5%時其去除率達到最高為66.0%，但與鹽度為2.0%時差異不明顯。隨著鹽度的進一步升高，N29亞硝酸鹽去除率下降，在鹽度為3.0%和3.5%時其去除能力均顯著低于鹽度2.5%時。培養(yǎng)48 h后N29在鹽度為2.5%時去除率最高為94.4%，各鹽度梯度下差異不明顯，去除率總體均維持在93%左右(圖4)。

圖4 鹽度對亞硝酸鹽去除能力的影響

溫度梯度試驗結(jié)果顯示，菌株N29培養(yǎng)24 h，其亞硝酸鹽去除率先隨著溫度的上升而提高，至溫度為35 ℃時其去除率達到最高為58.3%，顯著高于20 ℃和25 ℃時的去除率。但與30 ℃時去除率十分接近。培養(yǎng)48 h后N29亞硝酸鹽去除率的變化趨勢與24 h時相似，也是先隨著溫度的上升而顯著升高，至30 ℃時達到最高為92.9%，35 ℃時略有下降但與30 ℃時差異不顯著(圖5)。結(jié)果表明，溫度對N29亞硝酸鹽降解率的影響較大，適宜的溫度為30～35 ℃。

圖5 溫度對亞硝酸鹽去除能力的影響

3 小結(jié)與討論

本研究通過富集培養(yǎng)和分離純化從南美白對蝦高位精養(yǎng)池養(yǎng)殖后期水體中篩選到一株高效去除亞硝酸鹽的菌株。高位精養(yǎng)池在養(yǎng)殖過程中由于養(yǎng)殖動物體重增加，池塘承載量明顯加大，且養(yǎng)殖水體中大量的殘餌、動物排泄物和死亡殘體積累，水質(zhì)情況很容易惡化，亞硝酸鹽濃度急劇升高，因此采取有效的水質(zhì)調(diào)控措施尤為重要。在高濃度亞硝酸鹽的后期養(yǎng)殖水體中可能天然存在對亞硝酸鹽有較好的耐受性和較高去除率的菌株，直接從自然條件下的養(yǎng)殖水體中篩選去除亞硝酸鹽的菌株是尋找適合臨床應(yīng)用菌株的捷徑。經(jīng)該方法獲取的菌株是水體中正常菌群成員之一，對養(yǎng)殖環(huán)境具有很強的適應(yīng)性和較小的生物安全風險。本研究中篩選到的南美白對蝦高位精養(yǎng)池亞硝酸鹽去除菌經(jīng)16S rRNA測序和生理生化檢測鑒定為地衣芽孢桿菌。芽孢桿菌能分泌豐富的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶等高活性酶類，可分解養(yǎng)殖環(huán)境中碳系、氮系、磷系、硫系污染物和復(fù)雜多糖、蛋白質(zhì)和水溶性有機物，從而降低水體富營養(yǎng)化并減少底泥生成，且在其生長繁殖過程中會分泌一些細菌素等物質(zhì)，對養(yǎng)殖水體中的異養(yǎng)細菌、弧菌等致病菌的生長和繁殖具有一定的抑制作用[12]。芽孢桿菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的水質(zhì)改良益生菌，但目前在水質(zhì)的凈化作用方面研究較多的主要還是枯草芽孢桿菌[13-15]。對于地衣芽孢桿菌在水質(zhì)亞硝酸鹽凈化中的作用，曹煜成等[16-17]研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌可顯著降低黃鰭鯛(Acanthopagruslatus)、草魚(Ctenopharyngodonidellus)等養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝酸鹽的含量，使水質(zhì)得到顯著改善。白小麗等[18]采用枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌混合制劑對鱖(Sinipercachuatsi)及餌料魚池塘進行水質(zhì)調(diào)控，發(fā)現(xiàn)亞硝態(tài)氮的最大降解率可達77.5%。本研究中篩選到N29菌株對亞硝酸鹽的降解率可達到90%以上，表明N29有較高的去除亞硝酸鹽能力，可以用于開發(fā)新型的高效水質(zhì)凈化微生物態(tài)制劑。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖水體的理化因子一直處于不斷變化中，而微生物的水質(zhì)凈化能力會受理化因子波動的影響。李炎生等[19]從活性污泥中分離篩選到一株異養(yǎng)型亞硝酸鹽氧化細菌，當溫度為30 ℃時菌株硝化作用最強, 溫度高于或低于此溫度都不利于菌株其硝化作用的進行，另外適度的鹽濃度(1 g·L-1)對硝化細菌氧化亞硝酸鹽具有一定的促進作用, 但是鹽濃度過高反過來又會抑制硝化反應(yīng)的進行。熊焰等[20]從養(yǎng)殖水體中篩選到一株降解亞硝酸鹽的巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)，研究發(fā)現(xiàn)pH值為5.5～7.0 時，菌株對亞硝酸鹽的降解率隨pH值的升高而上升；pH 值為7.0～8.5時，菌株對亞硝酸鹽的降解率隨pH值的升高而降低，pH值為7.0 時降解率最高達80.2%；溫度從18 ℃到33 ℃過程中，菌株對亞硝酸鹽的降解率逐步升高，從33 ℃到50 ℃時降解率呈下降趨勢，在28～33 ℃, 菌株的降解率較高平均達88.9%。本研究單因素試驗結(jié)果表明：pH值在7.0～8.5時N29去除亞硝酸鹽能力隨pH值升高呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，其中pH值為7.5時去除率最高，且在pH值為7.0～8.0均可以達90%以上；鹽度在2.0%～3.5%時N29亞硝酸鹽去除率沒有顯著差異，說明其有較廣適鹽性；溫度對N29亞硝酸鹽去除率有較明顯的影響，其亞硝酸鹽去除率先隨著溫度的上升顯著提高，至溫度為30～35 ℃時其去除率最高。溫度對菌株去除亞硝酸鹽有顯著影響，這可能一方面是由于溫度會影響微生物的生長增殖及代謝活動，另一方面是因為硝化作用過程本身包含了一系列的酶促反應(yīng)，其反應(yīng)速率也受溫度影響?？傮w而言，N29去除亞硝酸鹽的適宜pH值為7.5～8，鹽度為2.0%～3.5%，適宜的溫度為30～35 ℃，具有較廣的pH值和鹽度適應(yīng)范圍，比較適合用于夏季南美白對蝦高位精養(yǎng)池養(yǎng)殖模式下水質(zhì)亞硝酸鹽的調(diào)節(jié)，但是關(guān)于其在生產(chǎn)養(yǎng)殖過程中實際水質(zhì)調(diào)控效果還需后續(xù)進一步研究。

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