馬 帥，王紀華，高 媛，王 蒙*，馮曉元*

（北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究中心，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（北京），農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地環(huán)境監(jiān)測北京市重點實驗室，北京 100097）

花椰菜（Brassica oleracea L. var. botrytis L.）又稱花菜、菜花或椰菜花，花椰菜為十字花科蕓苔屬一年生植物。西蘭花（B. oleracea L. var. italica）又名綠菜花、青花萊、嫩莖花椰菜，屬十字花科蕓苔屬甘藍種的一個變種，原產(chǎn)于意大利[1]?；ㄒ撕臀魈m花中含有酚酸類化合物、類胡蘿卜素、礦物質(zhì)元素和纖維素等多種功能性物質(zhì)，其中酚酸類化合物尤其重要，其抗氧化能力高于VC、VE和類胡蘿卜素等[2-3]。此外，已有研究表明花椰菜和西蘭花中含有豐富的抗癌物質(zhì)[4-5]，平均營養(yǎng)價值及防病作用超出其他蔬菜，對人體健康有重要作用。

酚酸是指結構中帶有酚類基團的有機酸，約占植物源食品中酚類化合物的1/3，多為苯甲酸和肉桂酸的羥化衍生物，主要以游離和束縛形式存在[6]。酚酸廣泛存在于蔬菜、水果、豆類等植物中，近年來，大量研究表明酚酸類成分具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗菌等生理活性作用，對防御紫外線輻射和降低多種疾病的發(fā)生等效果顯著[7-9]。

目前，文獻報道對于酚酸的質(zhì)量評價分析方法主要有毛細管電泳法[10]、薄層色譜法[11]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[14-15]等。在酚酸各種分析方法中，毛細管電泳法和薄層色譜法所費時間較長，一般要幾到幾十小時；采用氣相色譜技術檢測時，需先對酚酸物質(zhì)衍生后再測定，酚酸沸點較高且不容易氣化，過程相對繁瑣。超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）比高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）具有分離效果好、靈敏度高和峰容量大等優(yōu)點；MS/MS法可以給出每一個組分的相對分子質(zhì)量和豐富的結構信息，比MS靈敏度及選擇性均顯著提高，同時可以降低基質(zhì)干擾和信噪比，測定結果更加準確可靠。UPLC-MS/MS采用多重反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式進行定量分析，具有分離效率高、分析速度快、結果準確等特點，更適于多種酚酸的分離分析，在近幾年得到了快速的發(fā)展。方玲玲等[16]建立了UPLC-MS/MS技術同時檢測櫻桃酒中沒食子酸、4-羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸和咖啡酸5 種生物活性酚酸的方法，該方法簡便、快速、準確、靈敏，可用于櫻桃酒中酚酸的檢測。羅益遠等[17]采用UPLC-MS/MS法測定何首烏中的酚酸。艾鑫衛(wèi)等[18]采用HPLC-MS/MS法測定各生長期紫蘇中酚類物質(zhì)的含量。張娜等[19]通過超高效液相色譜法分析稻米酚酸化合物組分及其含量，該方法簡便、快速、準確、可靠，不僅適合稻米中酚酸化合物的含量測定，而且對于其他谷物中酚酸化合物含量的測定也具有一定參考價值。謝越等[20]采用HPLC法同時測定滁菊樣品中的9 種酚酸。目前，關于UPLC-MS/MS法花椰菜和西蘭花中酚酸類化合物測定的報道較少。本研究通過對UPLC-MS/MS條件的優(yōu)化，建立了UPLC-MS/MS同時測定花椰菜和西蘭花中23 種酚酸類化合物的分析方法，并采用該方法對5 個不同產(chǎn)地的花椰菜和西蘭花樣品進行分析測定和比較，以期為花椰菜和西蘭花功能營養(yǎng)評價及保健新品種開發(fā)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椰菜和西蘭花樣品采集于北京、杭州、武漢、重慶和廣州5 個產(chǎn)地，每個產(chǎn)地選取5 個有代表性的采樣點，將5 份樣品等比例混合為一份樣品（表1）。

表1 西蘭花、花椰菜的采樣記錄Table1 Information about vegetable samples tested in this study

酚酸標準品：沒食子酸、香豆酸、3,5-二羥基苯甲酸、新綠原酸、3,4-二羥基苯甲酸、2,3,4-三羥基苯甲酸、D-（-）-奎寧酸、綠原酸、4-羥基苯甲酸、2,5-二羥基苯甲酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、2,3-二羥基苯甲酸、鞣花酸、對香豆酸、芥子酸、阿魏酸、異阿魏酸、3-羥基肉桂酸、2-羥基肉桂酸、水楊酸、肉桂酸（純度均大于97%） 美國Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇（HPLC級） 美國Fisher公司；甲酸 （HPLC級）美國Sigma公司；抗壞血酸、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純） 上海安譜公司。

1.2 儀器與設備

ACQUITY UPLC儀-Xevo TQ三重四極桿質(zhì)譜儀（配MassLynx V.4.1軟件） 美國Waters公司；BUCHI-R-210旋蒸蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；A11分析研磨機、KS260搖床 德國IKA公司；Milli-Q超純水機 美國Mimpore公司；ME104E電子天平 瑞士梅特勒公司；Vortex Genie 2多用途旋渦混合器 美國Scientific Industries公司；N-EVAP氮吹儀 美國Organomation公司；pHS-3C精密pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酚酸提取

1.3.1.1 樣品研磨

取花椰菜和西蘭花樣品可食部位切成小塊，使用研磨機液氮研磨為粉末，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 游離型酚酸的提取

取2 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL提取液（80%甲醇溶液含有1%抗壞血酸），渦旋振蕩10 s，室溫超聲提取30 min，8 000 r/min離心5 min后將上清液轉移至50 mL容量瓶中。重復上述提取步驟一次，合并上清液，定容至50 mL，混勻后，過0.22 μm濾膜，備用。

1.3.1.3 游離酯型酚酸的提取

取2 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL提取液（80%甲醇溶液含有1%抗壞血酸），渦旋振蕩10 s，室溫超聲提取30 min，8 000 r/min離心5 min后將上清液轉移至100 mL旋蒸瓶中。重復上述提取步驟一次，合并上清液，于旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至10 mL以內(nèi)。轉移濃縮液至100 mL離心管中，加入20 mL 4 mol/L NaOH溶液，沖入氮氣密封。40 ℃氣浴振蕩避光水解2 h，后用4 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 2，加入20 mL正己烷，室溫振蕩20 min，去除正己烷層。用20 mL乙酸乙酯萃取2 次，合并萃取液于旋蒸瓶中，在旋轉蒸發(fā)儀上35 ℃減壓濃縮至進干。用10 mL 50%甲醇溶液溶解，混勻后，過0.22 μm濾膜，備用。

1.3.1.4 結合型酚酸的提取

取1.3.1.3節(jié)步驟離心后的殘渣，于100 mL離心管中，加入20 mL 4 mol/L NaOH溶液，沖入氮氣密封。40 ℃氣浴振蕩避光水解2 h，后用4 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 2，加入20 mL正己烷，室溫振蕩20 min，去除正己烷層。用20 mL乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取液于旋蒸瓶中，在旋轉蒸發(fā)儀上35 ℃減壓濃縮至進干。用10 mL 50%甲醇溶液溶解，混勻后，過0.22 μm濾膜，備用。

1.3.2 酚酸標準溶液的配制

分別準確稱取23 種酚酸標準品各10 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1 mg/mL的各酚酸標準儲備液，在-20 ℃保存，可以使用12 個月。酚酸混合標準工作液采用梯度稀釋法現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.3 UPLC-MS/MS分析

色譜柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 column（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），柱溫45 ℃，樣品室溫度10 ℃，進樣量5 μL，流動相為0.1%甲酸溶液（A）和0.1%甲酸-乙腈溶液（B），流速0.3 mL/min，采用梯度洗脫，0～0.5 min，95% A；0.5～5 min，95%～70% A；5～95 min，70%～10% A；9.5～9.75 min，10%～95% A；9.75～12 min，95% A（表2）。

表2 流動相梯度條件Table2 Gradient mobile phase for UPLC

采用電噴霧電離源，采用MRM模式進行檢測，負離子模式掃描，離子源溫度為150 ℃，脫溶劑氣溫度為500 ℃，去溶劑氣流量為1 000 L/h，錐孔氣流速為150 L/h。目標化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)見表3。

2 結果與分析

2.1 UPLC-MS/MS條件優(yōu)化

酚酸類化合物分離的流動相體系主要包括甲醇-水和乙腈-水[21-22]，實驗考察兩種不同流動相體系以及在流動相中添加甲酸對酚酸類化合物分離效果的影響。結果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈作為流動相時的分離效果明顯優(yōu)于甲醇，在流動相中加入0.1%甲酸可減少色譜峰的拖尾，增強樣品中待測物的保留，提高了分離效果和靈敏度。因此，本實驗采用0.1%甲酸的乙腈溶液-0.1%甲酸溶液作為流動相。

在質(zhì)譜條件優(yōu)化中，考察正、負兩種離子模式測定23 種目標化合物的響應特點。結果顯示，23 種目標化合物在負離子模式下均有較強的響應，經(jīng)反復實驗，發(fā)現(xiàn)各目標成分在檢測條件下具有良好的穩(wěn)定性、較好的峰形和響應值。因此，選用負離子模式進行分析。

2.2 前處理條件優(yōu)化

花椰菜和西蘭花基質(zhì)復雜，通常需要一定的前處理去除色素及其他干擾物以提高酚酸提取效率。目前對于酚酸類檢測前處理主要有乙酸乙酯液液萃取法[23-24]和固相萃取法[25]。乙酸乙酯萃取主要是利用多酚在乙酸乙酯和水中的分配系數(shù)不同分離，該法為目前提取酚酸最為常用方法。HLB固相萃取法是一種基于反相保留的提取方法，并對各種極性非極性物質(zhì)都有均衡吸附作用。固相萃取法相比于傳統(tǒng)液液萃取法操作較為簡便。研究對兩種前處理方法進行比較，結果表明，乙酸乙酯萃取法的回收率高于固相萃取法，因此選用乙酸乙酯萃取法。

2.3 方法學考察結果

2.3.1 線性方程、檢出限和定量限結果

精密吸取1.3.2節(jié)的混合對照品溶液，置于10 mL容量瓶中，依次逐級稀釋，配制成一系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按照1.3.3節(jié)的條件進行分析。以對照品的峰面積（Y）對相應質(zhì)量濃度（X）進行線性回歸，得到回歸方程和線性相關系數(shù)。以各化合物信噪比為3時對應的質(zhì)量濃度為最低檢測限，結果見表4，23 種酚酸類化合物在1.0～500.0 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)（r2）均不低于0.992。混合對照品的色譜圖見圖1。

表4 目標化合物的線性方程、相關系數(shù)和檢出限Table4 Linear equations, correlation coefficients (r2) and limits of detection(LODs) for target compounds

續(xù)表4

圖1 23 種目標成分混合對照品的MRM色譜圖Fig. 1 MRM Chromatograms of twenty-three components in reference substances

2.3.2 精密度、穩(wěn)定性和重復性實驗結果

表5 目標化合物的方法學考察結果Table5 Figures of merit of the method

取100 ng/mL的混合對照品溶液，在1 d內(nèi)連續(xù)進樣6 次，計算23 種目標成分峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。取同一樣品供試品溶液，分別在0、2、4、6、12、24 h進樣6 次，測定23 種目標化合物峰面積的RSD，考察其穩(wěn)定性。取同一樣品，按照2.3.1節(jié)方法平行制備3 份供試品溶液，分別進樣測定峰面積，計算23 種目標成分峰面積的RSD，考察方法的重復性。結果表明，儀器精密度良好，23 種目標化合物在24 h內(nèi)穩(wěn)定，方法的重復性好，結果見表5。方法精密度、重復性和穩(wěn)定性良好，RSD均小于5.10%。

2.3.3 加標回收率實驗結果

取2 g（6 份）已知含量的西蘭花樣品于離心管中，分別加入100 ng/g的對照品溶液，按照1.3.1節(jié)的方法制備加樣回收率供試品溶液，進行測定并計算目標化合物的回收率及RSD，結果見表5。加標回收率為81.32%～100.39%，RSD均不大于6.21%。加標回收樣品（100 ng/g）的MRM色譜圖見圖2。

圖2 加標回收樣品（100 ng/g）的MRM色譜圖Fig. 2 MRM Chromatograms of spiked samples (100 ng/g)

2.3.4 實際樣品測定結果

按照1.3.1節(jié)方法制備5 個產(chǎn)地的花椰菜和西蘭花樣品，按照1.3.3節(jié)方法測定，根據(jù)相應的線性計算供試樣品23 種酚酸的含量，結果見表6、7。測定樣品的MRM色譜圖見圖3。

圖3 測定樣品的MRM色譜圖Fig. 3 MRM chromatograms of real samples

如表6所示，花椰菜中共檢出9 種酚酸。其中，游離形態(tài)酚酸檢出芥子酸（0.11～0.13 mg/kg）和對羥基苯甲酸（0.43～1.19 mg/kg），不同產(chǎn)地的游離酚含量差異顯著。酯型酚含量為0.32～4.28 mg/kg，其中產(chǎn)地北京的花椰菜中酯型酚含量均顯著高于其他4 個產(chǎn)地，可能是由于貯運造成酯型酚降解。結合酚檢測出3 種，芥子酸（0.87～1.59 mg/kg）、阿魏酸（0.30～0.99 mg/kg）和對香豆酸（0.28～0.53 mg/kg）。不同產(chǎn)地花椰菜中所檢出的3 種形態(tài)的酚酸含量有差異顯著，這可能與花椰菜品種、采收成熟度及貯運時間等有關。與文獻[26-27]的研究結果比對發(fā)現(xiàn)，本研究檢出的2,3-二羥基苯甲酸和對羥基苯甲酸文獻中未見報道，文獻中綠原酸和丁香酸的檢測在本研究中未檢出，可能是由于前處理和檢測方法不一致。

西蘭花中共檢出10 種酚酸，如表7所示，其中，游離形態(tài)酚酸檢出2 種：新綠原酸含量為0.82～3.09 mg/kg，對羥基苯甲酸含量為0.29～1.10 mg/kg。酯型酚中芥子酸（24.61～62.89 mg/kg）和阿魏酸（21.08～43.26 mg/kg）含量較高，其余幾種酯型酚含量均低于10 mg/kg。結合酚檢出芥子酸（3.40～5.99 mg/kg）、阿魏酸（4.61～7.83 mg/kg）和對香豆酸（0.59～0.80 mg/kg）。不同產(chǎn)地西蘭花中所檢出的3 種形態(tài)的酚酸含量差異顯著，這可能與西蘭花的品種、采收成熟度及貯運時間等有關。與文獻[28-29]研究結果比對發(fā)現(xiàn)，本研究檢出的2,3-二羥基苯甲酸、原兒茶酸、龍膽酸和對羥基苯甲酸文獻中沒有報道，綠原酸本研究未檢出，可能是由于前處理和檢測方法不一致。

表6 不同產(chǎn)地花椰菜中不同形態(tài)酚酸含量（s，n=3）Table6 Contents of phenolic acids in cauliflower from different producing areas s, n= 3)

表6 不同產(chǎn)地花椰菜中不同形態(tài)酚酸含量（s，n=3）Table6 Contents of phenolic acids in cauliflower from different producing areas s, n= 3)

注：ND.未檢出。表7同。

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表7 不同產(chǎn)地西蘭花中不同形態(tài)酚酸含量s，n=3）Table7 Contents of phenolic acids in broccoli from different producing areass, n= 3)

表7 不同產(chǎn)地西蘭花中不同形態(tài)酚酸含量s，n=3）Table7 Contents of phenolic acids in broccoli from different producing areass, n= 3)

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3 結 論

酚酸類化合物的準確定性定量分析是開展蔬菜營養(yǎng)品質(zhì)研究及功能性食品研發(fā)必備的技術基礎。目前已有一些采用普通高效液相色譜測定紫山藥、果蔬汁和紫蘇中酚酸類化合物的研究報道[18,30-31]。但是普通高效液相色譜存在分析時間較長、分離度較差等問題，難以實現(xiàn)多種酚酸的聯(lián)合分析測定。本研究通過UPLC-MS/MS法，在9 min內(nèi)快速有效地分離23 種酚酸化合物，顯著提高了酚酸類化合物的分離效率，采用MRM模式進行定性定量分析，方法靈敏度及選擇性均顯著提高，同時可以降低基質(zhì)干擾和信噪比，測定結果更加準確可靠。本研究建立的UPLC-MS/MS法能夠快速、準確地測定花椰菜和西蘭花中23 種酚酸化合物，23 種化合物的線性關系良好，相關系數(shù)r2均不低于0.992，回收率在81.32%～100.39%之間，RSD均不大于6.21%。該方法顯著縮短了分析時間，而且穩(wěn)定性好、靈敏度高，可以為花椰菜和西蘭花等蔬菜中酚酸類功能營養(yǎng)評價及保健新品種開發(fā)提供技術支持。

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