蒼金榮，王 翠，王 曦，陳 苗，魏?jiǎn)疵簦瑥埨麄b，馬 娟，李 玲

(1.陜西省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710068；2.西安市紅會(huì)醫(yī)院，西安 710054)

臨床上，絲狀真菌感染常發(fā)生在腫瘤、艾滋病、惡性血液病、器官移植、透析、糖尿病、大面積燒傷、創(chuàng)傷等患者。絲狀真菌感染對(duì)人體危害嚴(yán)重，治療困難，由其引起的血流感染和侵襲性肺部感染及其他器官感染往往是致命性的，而不同種屬絲狀真菌對(duì)抗真菌藥物的敏感性不同，一些真菌對(duì)臨床常用抗真菌藥天然耐藥，因此，實(shí)驗(yàn)室確定絲狀真菌種屬非常重要。過(guò)去絲狀真菌實(shí)驗(yàn)室診斷主要依靠形態(tài)學(xué)，即培養(yǎng)觀察菌落形態(tài)、菌絲、孢子及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)進(jìn)行鑒定，這種方法費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，一般需要數(shù)天甚至數(shù)周時(shí)間，且受檢驗(yàn)人員專業(yè)技術(shù)水平限制，不能滿足臨床需要。

近年來(lái)臨床實(shí)驗(yàn)室采用PCR，基因測(cè)序、MALDI-TOF質(zhì)譜儀等先進(jìn)的技術(shù)方法來(lái)鑒定絲狀真菌，但是前兩種方法實(shí)驗(yàn)成本高、技術(shù)復(fù)雜且費(fèi)時(shí)，一般實(shí)驗(yàn)室難以開展；MALDI-TOF質(zhì)譜方法基于質(zhì)譜儀自帶的數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)培養(yǎng)的菌株蛋白質(zhì)分子譜系分析來(lái)對(duì)微生物鑒定診斷，其鑒定正確度高，具有成本和技術(shù)優(yōu)勢(shì)及很高的應(yīng)用價(jià)值[1]，已在一些大型實(shí)驗(yàn)室普遍應(yīng)用。目前，應(yīng)用布魯克microflex LT MALDI-TOF質(zhì)譜儀鑒定絲狀真菌，其樣本前處理沒有統(tǒng)一規(guī)定的方法，該儀器推薦的是垂直旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法，但整個(gè)前處理流程操作繁瑣，費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，并存在實(shí)驗(yàn)室污染的安全隱患，為了解決這一實(shí)驗(yàn)室難題，作者摸索并創(chuàng)新性建立了布魯克microflex LT MALDI-TOF質(zhì)譜儀絲狀真菌“雙甲酸夾心”樣本快速前處理方法并初步用于臨床實(shí)驗(yàn)室絲狀真菌的鑒定。

1材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 以2017年1月～2018年3月陜西省人民醫(yī)院門診及住院患者的痰液、肺泡灌洗液、血液、引流液、胸腔積液、腹腔積液、穿刺液、關(guān)節(jié)液、耳道分泌物、皮屑、甲屑、組織等標(biāo)本分離到的各種絲狀真菌共158株為研究對(duì)象。

1.2 儀器與試劑 microflex LT MALDI-TOF質(zhì)譜儀及配套器材購(gòu)自Bruker 公司；分離培養(yǎng)基有沙保弱瓊脂平板、營(yíng)養(yǎng)血瓊脂平板、麥康凱平板。

1.3 方法 在生物安全柜中，于96孔不銹鋼靶板上用無(wú)菌微量吸頭滴加1 μl甲酸，再選取培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的絲狀真菌菌落(幼齡菌絲體最好)用蘸取少許甲酸溶液的無(wú)菌牙簽挑取菌絲體與甲酸溶液混合，并進(jìn)行充分研磨，待其自然干燥后在其表面再次滴加1 μl的甲酸溶液，干燥后再加1 μl基質(zhì)液(儀器配套)，待干燥后即可上機(jī)檢測(cè)，再與真菌數(shù)據(jù)庫(kù)(或自建庫(kù))對(duì)質(zhì)譜峰圖進(jìn)行分析比較，根據(jù)制造商提供的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。采用形態(tài)學(xué)[2～4]和基因測(cè)序的方法確認(rèn)質(zhì)譜結(jié)果的正確性。

2結(jié)果采用“雙甲酸夾心”樣本快速前處理方法處理后經(jīng)布魯克microflex LT MALDI-TOF質(zhì)譜儀鑒定的絲狀真菌包括：黃曲霉菌復(fù)合群41株，煙曲霉菌38株，土曲霉菌4株，雜曲霉菌3株，構(gòu)巢曲霉菌3株，黑曲霉菌5株，茄病鐮刀菌、層生鐮刀菌、串珠鐮刀菌各1株，其他鐮刀菌屬2株，傘枝橫梗霉3株，米根霉4株，紅色毛癬菌31株，斷發(fā)毛癬菌2株，指間毛癬菌1株，青霉菌屬3株，尖端賽多孢菌2株，鏈格孢霉3株，康氏木霉1株，球毛殼菌3株，宛氏擬青霉1株，淡紫擬青霉2株，裂褶菌1株，紅色單囊菌1株(自建庫(kù))，馬爾尼菲籃狀菌1株(自建庫(kù))，鑒定到種的占71.5%(113/158)，鑒定到屬的占19.6%(31/158)，分值較低及未鑒定出來(lái)的占8.9%(14/158)(其中紅色單囊菌和馬爾尼菲籃狀菌為自建庫(kù))。

3討論真菌是廣泛分布于自然界的一大類真核生物，目前已知的對(duì)人類有致病性的真菌有500余種。臨床上感染的真菌除常見的假絲酵母菌屬、隱球菌屬外，一些原來(lái)對(duì)人畜不致病的真菌轉(zhuǎn)而致病的情況屢屢發(fā)生。近年來(lái)，絲狀真菌感染發(fā)病率居高不下，由其引起的感染造成的人體危害更為嚴(yán)重[5]。因此，早診斷、早治療尤為重要。

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)是一種可用于檢測(cè)大分子物質(zhì)的“軟電離”質(zhì)譜分析技術(shù)。近年來(lái)，該技術(shù)在病原微生物尤其是細(xì)菌的研究中被證實(shí)是一種準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的檢驗(yàn)方法[6～8]。隨著MALDI-TOF MS 技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，其在致病性真菌研究中的作用也日顯突出[9]。應(yīng)用布魯克microflex LT MALDI-TOF質(zhì)譜儀鑒定絲狀真菌，目前普遍的前處理實(shí)驗(yàn)操作方法是把培養(yǎng)基長(zhǎng)出的真菌菌落挑取菌絲植入液體培養(yǎng)基在搖床上持續(xù)培養(yǎng)(1～2天)，然后經(jīng)離心、洗滌、甲酸萃取等操作(耗時(shí)1 h左右)再上機(jī)鑒定，其操作步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

筆者以布魯克microflex LT MALDI-TOF質(zhì)譜儀器為平臺(tái)，建立了“雙甲酸夾心”樣本快速前處理方法，具有以下優(yōu)勢(shì)：①操作簡(jiǎn)單： 此操作過(guò)程到檢出結(jié)果僅需要10多分鐘，與目前該質(zhì)譜儀推薦的鑒定前處理樣本的繁瑣實(shí)驗(yàn)操作步驟相比較，縮短了實(shí)驗(yàn)流程，具有省時(shí)、高效、極低實(shí)驗(yàn)成本，減少原方法在樣本培養(yǎng)及處理過(guò)程中可能的實(shí)驗(yàn)室污染和產(chǎn)生的生物安全隱患。②早期鑒定：傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法依靠培養(yǎng)后菌落生長(zhǎng)速度、形態(tài)、顏色等特征以及鏡下形態(tài)特點(diǎn)和產(chǎn)孢方式進(jìn)行鑒定，需要檢驗(yàn)人員有豐富的絲狀真菌鑒定經(jīng)驗(yàn)，另外絲狀真菌生長(zhǎng)緩慢，通常需要數(shù)天甚至數(shù)周才能呈現(xiàn)較明顯的菌落菌體特點(diǎn)；國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道MALDI-TOF質(zhì)譜儀樣本前處理推薦的甲酸提取法在菌株培養(yǎng)到5天時(shí)鑒定結(jié)果較好，鑒定率可達(dá)85.9%[10]。但以上方法均耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，患者往往已經(jīng)錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)間。我們新建立的“雙甲酸夾心法”對(duì)于培養(yǎng)基上早期生長(zhǎng)的真菌菌落(幼齡菌絲體最佳)就可以進(jìn)行快速前處理上機(jī)鑒定，操作簡(jiǎn)便快速，大大縮短了鑒定時(shí)間。使用“雙甲酸夾心法”在菌落生長(zhǎng)2天鑒定結(jié)果最好，鑒定到種屬的幾率最高。③對(duì)培養(yǎng)基沒有特殊選擇：即任何培養(yǎng)基生長(zhǎng)的絲狀真菌都可用該方法處理后上機(jī)鑒定。④鑒定效果好：能鑒定到種屬的菌株高達(dá)91.1%，且對(duì)形態(tài)不典型或少見的絲狀真菌都能正確鑒定到種，如白色煙曲霉菌、白色土曲霉菌、球毛殼菌、普通裂褶菌、尖端賽多孢菌、紅色單囊菌、馬爾尼菲籃狀菌等。

從我們實(shí)驗(yàn)研究和初步臨床應(yīng)用來(lái)看，布魯克microflex LT MALDI-TOF質(zhì)譜儀絲狀真菌鑒定“雙甲酸夾心”樣本快速前處理方法具有較高的推廣應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1] McTaggart LR，Lei E，Richardson SE，et al．Notes:Rapid identification ofCryptococcusneoformansandCryptococcusgattiiby matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry[J]．J Clin Microbiol，2011，49(8)：3050-3053．

[2] 陳東科，孫長(zhǎng)貴．實(shí)用臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)與圖譜[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2011．

[3] 盧洪洲，錢雪萍，徐和平．醫(yī)學(xué)真菌檢驗(yàn)與圖譜[M]．上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2017．

[4] 王建中．臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)圖譜(下冊(cè))[M]． 北京：人民衛(wèi)生出版社，2012．

[5] 馬 珍，吳麗娟．臨床絲狀真菌感染病例報(bào)告與分析[J]．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2006，13(9)：440-441．

[6] Mellmann A，Cloud J，Maier T，et al．Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry in comparison to 16S rRNA gene sequencing for species identification of nonfermenting bacteria[J]．J Clin Microbiol，2008，46(6)：1946-1954．

[7] Saffert RT，Cunningham SA，Ihde SM，et al．Comparison of bruker biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometer to BD phoenix automated microbiology system for identification of gram-negative bacilli[J]．J Clin Microbiol，2011，49(3)：887-892．

[8] Seng P，Drancourt M，Gouriet F，et al．Ongoing revolution in bacteriology：routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry[J]．Clin Infect Dis，2009，49(4)：543-551．

[9] 吳 婕，張 萍．基質(zhì)輔助激光解析-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析技術(shù)在致病性細(xì)菌研究中的應(yīng)用[J]．儀器儀表與分析監(jiān)測(cè)，2010(2)：1-4．

Wu J,Zhang P.Study on pathogenic by Matrix-assisted Laser desorption/ionization time of fight mass spectrometry[J]．Instrumentation Analysis Monitoring，2010(2)：1-4．

[10] Del Chierico F，Masotti A，Onori M，et al．MALDI-TOF MS proteomic phenotyping of filamentous and other fungi from clinical origin[J]．J Proteomics，2012，75(11)：3314-3330．