梁煥坤，葉景文，李佳麗，陳翠翠，郭曉曉，劉細潘，鐘樹海，黎杰星，李來慶

廣州優(yōu)迪生物科技股份有限公司，廣東 廣州 510663

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，占我國泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率的第1位，而在西方其發(fā)病率僅次于前列腺癌，居第2位[1-2]。2012年全國腫瘤登記地區(qū)膀胱癌的發(fā)病率為6.61/10萬[3-4]，列惡性腫瘤發(fā)病率的第9位。膀胱癌復(fù)發(fā)率高[5]，復(fù)發(fā)后的病例常伴有腫瘤病理分級增加、肌層浸潤或遠處轉(zhuǎn)移。因此，早期做出正確的診斷對疾病的治療與預(yù)后有重要的臨床意義。目前臨床上面測定癌胚抗原（CEA）和核基質(zhì)蛋白22（NMP22）的方法，都是采用單標記方法，即1次檢測只能得到1種標志物的含量，通量較小。本研究以雙抗夾心法，建立同時檢測CEA和NMP22的雙標記時間分辨免疫熒光分析（TRFIA）法，為膀胱癌快速準確檢測提供新的理念和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

抗CEA和NMP22單克隆抗體自制；Eu3+標記試劑盒購自PerkinElmer；BSA來源于Fitzgerald；Sephades-G50填料購自GE；96孔板購自Costar；CEA測定試劑盒（酶聯(lián)免疫法）購自北京熱景生物公司；包被緩沖液、洗滌液、封閉液、增強液均為自制。DR-6606時間分辨熒光分析儀購自廣州市達瑞生物技術(shù)股份有限公司。88份膀胱癌陽性尿液樣品和60份膀胱癌陰性血液樣品均由濟南軍區(qū)第88醫(yī)院提供。

1.2 固相包被抗體的制備

用50 mmol/L、pH 9.6的碳酸鹽緩沖液將CEABSA和NMP22-BSA的包被原稀釋成2 μg/mL，100 μL/孔同時加入到96孔板中，4 ℃過夜，棄包被液，加入封閉液，37 ℃封閉2 h，棄掉封閉液，洗滌，真空抽干冷凍并于–20 ℃保存

1.3 Eu3+和Sm3+標記抗體

將0.5 mg標記抗體加入Millipore的帶有濾膜的離心管中，8000 r/min離心8 min。再用標記緩沖液（50 mmol/L，Na2CO3，pH 9.0）重復(fù)洗滌6次。將200 μL標記抗體和50 μg銪（或釤）標記試劑充分混勻，25 ℃振蕩過夜。

1.4 Eu3+和Sm3+標記抗體的純化

標記完成后用Sephadex G-50層析柱分離純化，洗脫液（含0.9% NaCl的50 mmol/L的Tris-HCl）洗脫，同時收集流出液（1 mL/管），逐管測量吸光度（A280），測定蛋白含量，根據(jù)Eu3+和Sm3+標記試劑盒說明書所提供的公式測定標記率和蛋白回收率。

1.5 標準品的制備

用含0.2%BSA，0.1%NaN3，50 mmol/L的pH 7.8 Tris-HCl緩沖液，將CEA蛋白稀釋成0、1、5、25、50、250、500、600 ng/mL系列參考標準溶液；將NMP22蛋白稀釋成0、1、10、50、100、500、1000 U/mL系列參考標準溶液，每瓶1 mL分裝，–20 ℃保存?zhèn)溆?。檢測CEA和NMP22的標準曲線，用雙對數(shù)數(shù)學(xué)模型（Log-Logit）擬合。

1.6 分析操作程序

向包被酶聯(lián)板上加入25 μL CEA/NMP22參考標準品或待測血清，再加入200 μL分析緩沖液，震蕩溫育1 h，洗滌液洗滌4次，再加入以分析緩沖液1:50～1:100倍稀釋的Eu3+-CEA單克隆抗體與Sm3+-NMP22單克隆抗體的混合物200 μL/孔，震蕩溫育1 h，洗滌液洗滌6次，最后加入增強液200 μL/孔震蕩5 min后在時間分辨熒光檢測儀上進行檢測。

1.7 TRFIA法性能檢測

（1）稀釋回收率：從收集的88份膀胱癌陽性患者尿液樣品中隨機抽取3份尿液樣本，其CEA的濃度分別為：24、58、73 ng/mL，取另3個患者的尿液，其NMP22的濃度分別為：26、99、133 U/mL，稀釋濃度均為1:20、1:40、1:80倍比稀釋，每個樣本重復(fù)3次，重復(fù)檢測3次，比較樣本的測定值、真值及其比值。（2）線性范圍：CEA抗原和NMP22作為標準品稀釋成不同濃度進行測定，CEA濃度為0、1、5、25、50、250、500、600、800、1600 ng/mL，NMP22濃度為0、1、10、50、100、500、1000、1250、5000 U/mL，每個濃度測定3個復(fù)孔，重復(fù)測定3次，進行劑量線性回歸分析和計算試驗的相關(guān)系數(shù)。（3）靈敏度：以零參考標準品（CEA和NMP22抗原）當做樣本，將測定20次的熒光值均值加上2倍的標準差代入標準曲線方程，計算出最低檢測量。（4）精密度：將自制的質(zhì)控品（CEA和NMP22抗原）稀釋至高、中、低3個濃度，各設(shè)3個復(fù)孔重復(fù)檢測10次，計算各質(zhì)控品檢測值的均數(shù)、標準差及變異系數(shù)（CV）值。（5）穩(wěn)定性：自制的試劑盒置于4 ℃冰箱6月和37 ℃ 7 d，對試劑盒的物理外觀，劑量-反應(yīng)曲線的線性、準確度、靈敏度、最低檢測量等指標進行測定，具體檢測方法同上步驟（1）和（4）。（6）與其他膀胱癌檢測方法比較：用自行制備的CEA和NMP22雙標記時間分辨熒光檢測試劑盒與人CEA ELISA檢測試劑盒、病理學(xué)同時檢測已用膀胱尿道鏡檢確定的88例膀胱癌尿液樣本和60份膀胱癌陰性尿液樣本，對檢測結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果

2.1 標記物的標記率和回收率

Eu3+和Sm3+標記物的標記率分別為9.53/抗體、9.25/抗體，蛋白回收率為分別89.4%、91.10%。

2.2 雙標記CEA/NMP22標準曲線

CEA和NMP22標準曲線和相關(guān)系數(shù)分別為：CEA：y=0.9847x+4.0943，R2=0.9995； NMP22：y=1.0198x+3.9834，R2=0.9994，表明線性相關(guān)性良好，其劑量-反應(yīng)曲線如圖1所示，表明本試劑盒有良好的劑量-反應(yīng)效應(yīng)。

2.3 稀釋回收率

CEA的回收率在95.89%～100.64%之間；NMP22的回收率在97.74%～103.3%之間。

2.4 線性范圍和靈敏度

CEA蛋白當濃度低于600 ng/mL時，熒光值呈線性升高（R2=0.9995，圖2A）；濃度高于600 ng/mL時，熒光值不再呈線性升高，曲線呈緩慢上升（圖2B），故CEA蛋白標準曲線的線性范圍為0～600 ng/mL。NMP22蛋白當濃度低于1000 ng/mL時，熒光值呈線性升高（R2=0.9994, 圖2C）；濃度高于1000 ng/mL時，熒光值不再呈線性升高，曲線呈緩慢上升（圖2D），故NMP22蛋白標準曲線的線性范圍為0～1000 ng/mL。以零參考標準品測定20次的熒光值均值加上2倍的標準差代入標準曲線方程，計算得出試劑盒檢測CEA的靈敏度為 0.12 ng/mL，NMP22的檢測靈敏度為0.21 U/mL。

2.5 精密度

用自制的CEA/NMP22的TRFIA試劑盒分析，批內(nèi)CV＜5%，批間CV＜10%（表2）。

圖1 雙標記CEA/NMP22標準曲線

表1 自制CEA/NMP22 TRFIA試劑盒回收率評價結(jié)果

圖2 試劑盒線性范圍測試結(jié)果圖

表2 自制CEA/NMP22的TRFIA試劑盒分析

2.6 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性測試結(jié)果表明，自制的試劑盒置于4 ℃冰箱能穩(wěn)定6月以上，37 ℃熱破壞性試驗?zāi)艹掷m(xù)7 d以上。

2.7 與膀胱癌其他診斷方法比較

自行制備的CEA/NMP22 TRFIA檢測試劑盒與CEA ELISA檢測試劑盒、病理學(xué)的檢測結(jié)果比較見表3～4。TRFIA試劑盒與膀胱尿道鏡檢方法比較，陽性率符合率為97.7%，陰性符合率為100%。

表3 幾種方法檢測膀胱癌尿液樣本的符合率（n=88）

表4 幾種方法檢測膀胱癌陰性尿液樣本的符合率（n=60）

3 討論

膀胱腫瘤標記物作為一種新興的膀胱癌診斷指標，是膀胱癌早期診斷、指導(dǎo)治療及評估預(yù)后的有效手段[7-15]。CEA最初發(fā)現(xiàn)于結(jié)腸癌及胎兒腸組織中，正常尿路上皮不存在癌胚抗原，但膀胱癌患者的血漿和尿中CEA卻明顯上升。連續(xù)監(jiān)測膀胱癌患者尿液中CEA水平可用于腫瘤治療的療效觀察及預(yù)后判斷[16-17]，對已確診的腫瘤病人的預(yù)后與評價治療效果有重要意義。

NMP22即細胞核有絲分裂器蛋白是核基質(zhì)蛋白家族中的一種，于1980年首次發(fā)現(xiàn)并命名，在膀胱癌上皮細胞內(nèi)的含量要比正常尿路上皮高數(shù)十倍。NMP22在細胞死亡后被釋放到尿液中，以可溶性復(fù)合物或片段的形式存在于人的尿液中，與尿路上皮腫瘤密切相關(guān)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗可以檢測其濃度[18]，這是NMP22作為臨床診斷膀胱移行細胞癌的依據(jù)。公開資料表明：NMP22檢測膀胱癌的總敏感性為73.2%～100%，特異性為85%～97%。更詳細的分析表明：NMP22診斷Ta和T1期的膀胱癌敏感性為71%，特異性為93.8%；而在T2-4期的腫瘤，其敏感度可顯著提高到92.6%，特異性93.8%[19]。美國FDA已經(jīng)批準NMP22用于膀胱癌的檢測，在檢測膀胱癌的臨床研究中顯示了較高的性能。

TRFIA是一種新型的體外超微量分析定量技術(shù)。它采用具有獨特熒光特性的鑭系元素及其螯合物為示蹤物代替熒光物質(zhì)、酶、同位素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，標記抗體、抗原、激素、多肽、蛋白質(zhì)、核酸探針及生物細胞，待反應(yīng)體系（如：抗原抗體反應(yīng)、核酸探針雜交、生物素親和素反應(yīng)以及靶細胞對效應(yīng)細胞的殺傷反應(yīng)等）發(fā)生后，用時間分辨熒光免疫分析檢測儀測定反應(yīng)產(chǎn)物中的熒光強度，根據(jù)產(chǎn)物熒光強度和相對熒光強度的比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，從而達到定量分析。它克服了酶標記物的不穩(wěn)定、化學(xué)發(fā)光僅能1次發(fā)光且易受環(huán)境干擾、電化學(xué)發(fā)光的非直接標記等缺點，使非特異性信號降低到可以忽略的程度，達到了極高的信噪比，從而大大地超過了放射性同位素所能達到的靈敏度，且還具有標記物制備簡便、儲存時間長、無放射性污染、檢測重復(fù)性好、操作流程短、標準曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾和應(yīng)用范圍十分廣泛等優(yōu)點，成為90年代后非放射性免疫分析發(fā)展的新里程碑，正逐步推廣到瘤標監(jiān)測中[20]。

基于此，本研究團隊擬利用銪（Eu3+）標記抗CEA單克隆抗體和釤（Sm3+）標記抗NMP22單克隆抗體，采用雙抗體夾心法建立CEA/NMP22雙標記TRFIA試劑，自行研制能同時檢測人尿液CEA和NMP22的TRFIA試劑盒，本研究所研制的試劑盒測定結(jié)果顯示，試劑盒CEA的靈敏度為 0.12 ng/mL，NMP22的檢測靈敏度為0.21 U/mL。批內(nèi)CV小于5%，批間CV小于10%，達到臨床測試要求（批內(nèi)CV＜10%，批間CV＜15%）；試劑盒檢測樣本濃度CEA蛋白的線性范圍為0～600 ng/mL，NMP22蛋白的線性范圍為0～1000 ng/mL，檢測范圍寬。此外，本試劑盒的靈敏度高，可同時聯(lián)合檢測CEA與NMP22兩種腫瘤標志物，以期達到定量、快速、簡便、敏感的對膀胱癌做出早期診斷。

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