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        利用多重PCR技術(shù)構(gòu)建與PRDC相關(guān)的4種病毒病的快速檢測方法

        2018-02-05 21:04:08李世震盛金良
        畜牧獸醫(yī)科學(xué) 2018年2期
        關(guān)鍵詞:病料病原特異性

        李世震,盛金良

        (新疆石河子市一四二團(tuán)獸醫(yī)站,新疆 石河子 832029)

        現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展,由于集約化程度及環(huán)境等多重條件的影響,給養(yǎng)殖戶帶來的不只是經(jīng)濟(jì)利益的提高,同時(shí)也大大提高了疾病的發(fā)生幾率,尤其是大大提高了多種病混合感染的發(fā)病幾率。豬呼吸道疾病綜合征(Porcine Respiratory Disease Complex,PRDC)就是一種由病毒、細(xì)菌、環(huán)境應(yīng)激和豬體免疫力低下相互作用造成的一種多種因素多種病原混合感染的呼吸道疾病綜合征。通常由病毒或者霉形體首先侵襲住的呼吸道,破壞呼吸道的防御屏障,然后各種氣源性病菌就很容易進(jìn)入呼吸道和肺部,造成繼發(fā)性混合感染。

        造成豬呼吸道疾病綜合征的原發(fā)性病原主要為豬瘟病毒(classicalswinefever virus,CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproduetive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)、豬偽狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)等。這4種病毒病常常呈現(xiàn)混合感染,且可以不同程度的損傷免疫系統(tǒng),降低機(jī)體免疫了,從而加劇混合感染與發(fā)病程度。

        依照獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室“科學(xué),公正,準(zhǔn)確,高效”的診斷質(zhì)量方針,為了能夠快速、準(zhǔn)確的從根源上進(jìn)行疫病防控,迫切的需要一種能夠一次性檢測多種病原的檢測方法。多重PCR技術(shù)就是在傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上,在一個(gè)反應(yīng)體系中使用2對(duì)及以上的引物,對(duì)不同病原進(jìn)行擴(kuò)增,這種方法與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比,不僅大大減少了多種病原檢測的試驗(yàn)步驟,而且還保留了PCR技術(shù)的特異性與敏感性。

        1 材料與方法

        1.1 病料及相關(guān)試劑

        試驗(yàn)所使用的95份病料來自于新疆石河子市部分地區(qū)的10個(gè)規(guī)?;i場。TRIzol試劑購自于Invitrogen公司,Multiplex PCR MasterMix購自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司、DNA Maeker I購自北京天根生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司、快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;CSFV、PRRSV、PCV2、PRV擴(kuò)增所使用的模板均由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供;瓊脂粉購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;氯仿、異丙醇、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

        1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

        本實(shí)驗(yàn)為建立引起PRDC的4種病原的快速檢測方法,因此根據(jù)PCR反應(yīng)原理,每一種病原需要上下游引物各一條,共需要設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物。根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)特異性引物及序列如表1。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

        表1 目的片段擴(kuò)增所使用的引物

        1.3 樣品DNA和總RNA的提取

        95份病料樣品RNA提取步驟參照TRIzol說明書進(jìn)行即可,組織DNA提取按照DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行,提取出來的DNA保存在-20℃,RNA保存問無為-80℃。

        1.4 PCR反應(yīng)條件的選擇

        根據(jù)4種病原的單重PCR條件, CSFV,PRRSV、PCV2、PRV的多重PCR選用50ul反應(yīng)體系:Multiplex PCR MasterMix 25ul,CSFV、PRRSV、PCV2、PRV上下游引物(20umol/L)各1ul,4種模板各2ul,ddH2O補(bǔ)至50ul。

        反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s,60℃退火50s,72℃延伸90s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min,4℃保存。

        使用3.0%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳,在多重PCR的反應(yīng)體系里可以擴(kuò)增出來622bp、490bp、424bp、298bp4條可以清晰分辨的條帶,與單重PCR相比,條帶大小一致。

        2 結(jié)果分析

        使用建立的多重PCR方法對(duì)95份病料樣品進(jìn)行單重PCR與多重PCR擴(kuò)增對(duì)比,通過對(duì)比,兩種方法的符合率達(dá)到100%。

        3 討論

        隨著生豬規(guī)?;?、現(xiàn)代化、集約化養(yǎng)殖方式的轉(zhuǎn)變,多種病原混合感染的現(xiàn)象越來越普遍,豬群疾病的發(fā)生與流行對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害也越來越大,直接制約著生豬養(yǎng)殖的發(fā)展,影響經(jīng)濟(jì)發(fā)展。PRDC的這4種病原又是新疆地區(qū)規(guī)?;i場普遍存在的,往往發(fā)生混合感染、繼發(fā)感染等,而且單憑臨床癥狀很難對(duì)這幾種病做出準(zhǔn)確的診斷,傳統(tǒng)的診斷方法,存在操作復(fù)雜,過程繁瑣,費(fèi)時(shí)費(fèi)力等多種因素,因此,構(gòu)建一種快速的診斷方法對(duì)疫病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查都有極大的好處。利用多重PCR技術(shù)構(gòu)建的快速檢測方法,不僅保持了普通PCR技術(shù)的靈敏性和特異性,還能夠同時(shí)檢測4種病原,是一種快速、簡單、有效的實(shí)驗(yàn)室診斷檢測技術(shù)。

        [1]耿慶華,彭永剛,張波,裴程程.PCV2、PRV和PRRSV多重PCR方法的建立及其應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2014(09).

        [2]王隆柏,張志剛,蘇永裕,車勇良,吳學(xué)敏,周倫江.5種豬病多重PCR檢測方法的建立[J].中國畜牧獸醫(yī),2014(02).

        [3]王娟萍,姚敬明,趙喜有,吳忻,孟帆,劉文俊,樊振華,米瑞娟.豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型多重PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī),2012(08).

        [4]賀顯晶,孫東波,周玉龍,林云成,韓旭,王越強(qiáng),郭婷婷,武瑞.豬群中7種高發(fā)傳染病多重PCR診斷方法的建立[J].畜牧與飼料科學(xué),2010(09).

        [5]劉志杰.豬繁殖障礙性病毒性疫病六重PCR方法的建立與應(yīng)用研究[D].貴州大學(xué),2013.

        [6]郝曉芳.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及分子流行病學(xué)分析[D].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2008.

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