賀繼剛，韓金秀，李貝貝，李宏遠(yuǎn)，李洪榮，嚴(yán)丹

冠心病引起的心肌梗死(即心肌損傷)已成為目前世界范圍內(nèi)的頭號(hào)“殺手”。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)心肌梗死的治療主要分為外科冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)、內(nèi)科冠狀動(dòng)脈支架介入治療及干細(xì)胞修復(fù)治療。細(xì)胞治療中應(yīng)用最成熟的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），前期研究已經(jīng)證明BMSCs可以修復(fù)心肌損傷［1］，但目前國(guó)內(nèi)、外對(duì)干細(xì)胞療效的報(bào)道仍不盡然［1］。GATA-4是調(diào)控心臟基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，參與心臟正常發(fā)育、功能基因表達(dá)和心肌肥大的病理過(guò)程。本研究擬利用慢病毒攜帶GATA-4基因轉(zhuǎn)染小鼠BMSCs，探討過(guò)表達(dá)GATA-4-BMSCs修復(fù)心肌損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 于2015年3月—2016年12月，選取60只健康4周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(川)2015-030。動(dòng)物喂養(yǎng)、觀察均按照藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范（GLP）規(guī)定執(zhí)行。

1.2 主要試劑和儀器 C57BL/6小鼠BMSCs培養(yǎng)基（低糖培養(yǎng)基，含10%胎牛血清），購(gòu)自美國(guó)Cyagen Biosciences公司。CD29、CD44、CD11b、干細(xì)胞抗原1（SCA-1）抗體購(gòu)自美國(guó)BioLegend公司。CD11bMicroBeads購(gòu)自美國(guó)Miltenyi公司。番茄凝集素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。C-kit抗體購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。PHILIPS EPIQ 7C心臟超聲儀購(gòu)自荷蘭PHILIPS公司。熒光共聚焦顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。

1.3 小鼠BMSCs分離、培養(yǎng)及鑒定 將小鼠脫頸處死，75%乙醇浸泡15 min，取出股骨和脛骨，再以75%乙醇浸泡Ⅰ～Ⅱ min，置于0.9%氯化鈉溶液中，兩端剪斷暴露骨髓腔。1 ml注射器加0.9%氯化鈉溶液沖出骨髓，收集至無(wú)菌離心管中，以1 500×g離心10 min，以含10%胎牛血清的C57BL/6小鼠BMSCs培養(yǎng)基重懸細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，以2×106/cm2密度接種至25 cm2塑料培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。并標(biāo)記為原代。胰酶消化傳代至第3代時(shí)采用CD11b磁珠負(fù)選，去除造血干祖細(xì)胞。繼續(xù)傳代至第7代，取生長(zhǎng)至第7代的BMSCs，待細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時(shí)，制備單細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞檢測(cè)CD29、CD44、CD11b、SCA-1（PE-CD29單抗 5 μl按 1∶20 稀釋至 100 μl、PE/Cy5-CD445 μl按 1∶20 稀釋至 100 μl、PE-CD11b單抗 5 μl按 1∶40 稀釋至 100 μl、FITC anti-mouse SCA-1 5 μl按1∶20 稀釋至 100 μl）。

1.4 慢病毒載體及基因開(kāi)啟技術(shù)構(gòu)建過(guò)表達(dá)GATA-4-BMSCs 由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供GATA-4基因及GV308質(zhì)粒，將已構(gòu)建成功的GATA-4基因插入慢病毒包裝質(zhì)粒GV308中，構(gòu)建GV308-GATA-4重組慢病毒包裝質(zhì)粒，然后將其轉(zhuǎn)染入小鼠BMSCs并加入基因開(kāi)啟劑多西環(huán)素（DOX）。轉(zhuǎn)染成功后利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染72 h后過(guò)表達(dá)GATA-4-BMSCs中GATA-4 mRNA表達(dá)水平，以未轉(zhuǎn)染為陰性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 小鼠心肌梗死模型的建立 取20只小鼠，直視下氣管插管與小動(dòng)物呼吸機(jī)連接，由第3肋間進(jìn)入胸腔，以肺動(dòng)脈圓錐與左心耳右緣之間交點(diǎn)和心尖的假想連線為小鼠冠狀動(dòng)脈前降支走行標(biāo)志，以9-0縫線于左心耳根部下方縫扎?？p扎的方向和左心耳的下緣平行?？p扎成功標(biāo)志為左心室前壁及心尖周圍心肌組織運(yùn)動(dòng)減弱。縫合肋骨，關(guān)閉肋間隙。心肌梗死模型建模96 h時(shí)行病理切片證實(shí)建模是否成功。

1.6 檢測(cè)過(guò)表達(dá)GATA-4-BMSCs修復(fù)心肌損傷的效果

小鼠心肌梗死模型建模后48 h，將2.5 mmol/L（106/L細(xì)胞中加入2 μl濃度為2.5 mmol/L的Dir）BMSCs（n=3）、空載體-BMSCs（n=3）、過(guò)表達(dá)GATA-4-BMSCs（n=3）500 μl經(jīng)尾靜脈注射，并給予喂食含有DOX（0.25 mg/L）的液體。并將心肌梗死未處理組（n=3）及正常小鼠（n=3）同時(shí)給予喂食含有DOX（0.25 mg/L）的液體作為對(duì)照1組及對(duì)照2組。給予干預(yù)措施72 h后，采用心臟彩超（PHILIPS EPIQ 7C）評(píng)估心功能指標(biāo)，包括射血分?jǐn)?shù)（EF）、環(huán)比收縮（FS）、環(huán)比舒張直徑（LVIDd）、環(huán)比收縮直徑（LVIDs）。

1.7 相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定 完成心臟彩超后增加正常小鼠正常喂養(yǎng)（n=3）作為對(duì)照3組，將各組小鼠開(kāi)腹后經(jīng)下腔靜脈注射番茄凝集素（50 μg/ml；25 μl/10 g），于注射10 min后完成心臟小動(dòng)物活體成像檢測(cè)心臟區(qū)域熒光強(qiáng)度，將心臟分成兩部分放入4%多聚甲醛固定，一部分完成冰凍切片，采用熒光共聚焦顯微鏡（Nikon90i）檢查心肌血管數(shù)量。一部分完成石蠟包埋切片，按C-kit說(shuō)明書(shū)采用免疫組化檢測(cè)心肌梗死局部C-kit陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料的分析采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠BMSCs流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果 小鼠BMSCs CD29表達(dá)率為98.0%，CD44表達(dá)率為100.0%，CD11b表達(dá)率為0.1%，SCA-1表達(dá)率為99.5%。

2.2 RT-PCR方法檢測(cè)GATA-4 mRNA表達(dá)水平 陰性對(duì)照組GATA-4 mRNA表達(dá)水平為（0.57±0.34），過(guò)表達(dá)GATA-4-BMSCs組GATA-4 mRNA表達(dá)水平為（78.17±1.32），兩組GATA-4 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.576，P＜0.05）。

2.3 小鼠心肌梗死模型病理檢測(cè)結(jié)果 造模96 h后，心肌梗死模型小鼠左心腔變大，HE染色鏡下可見(jiàn)心肌梗死部位細(xì)胞排列紊亂，外形結(jié)構(gòu)輪廓不清，細(xì)胞水腫、壞死（見(jiàn)圖1、2）。

圖1 心肌梗死模型組織大體觀Figure 1 Tissue view of myocardial infarction model

圖2 心肌梗死模型HE染色鏡下觀（×200）Figure 2 HE staining of myocardial infarction model

2.4 各組小鼠心功能指標(biāo)變化值比較 各組小鼠LVIDd、LVIDs變化值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組小鼠EF、FS變化值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中對(duì)照2組FS惡化幅度低于對(duì)照1組，BMSCs組、空載體-BMSCs組、過(guò)表達(dá)GATA-4-BMSCs組EF、FS改善幅度高于對(duì)照1組和對(duì)照2組，過(guò)表達(dá)GATA-4-BMSCs組EF、FS改善幅度高于BMSCs組和空載體-BMSCs組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表1）。

表1 各組小鼠心功能指標(biāo)變化值比較（x±s）Table 1 Comparison of cardiac indexes changes in each group

2.5 各組小鼠心臟區(qū)域熒光強(qiáng)度比較 各組小鼠心臟區(qū)域熒光強(qiáng)度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中BMSCs組、空載體-BMSCs組、過(guò)表達(dá)GATA-4-BMSCs組心臟區(qū)域熒光強(qiáng)度高于對(duì)照1組、對(duì)照2組和對(duì)照3組；過(guò)表達(dá)GATA-4-BMSCs組心臟區(qū)域熒光強(qiáng)度高于BMSCs組和空載體-BMSCs組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表2、圖3）。

表2 各組小鼠心臟區(qū)域熒光強(qiáng)度比較（x±s）Table 2 Comparison of fluorescence imaging of cardiac in each group

圖3 各組小鼠心臟熒光成像圖Figure 3 Fluorescence imaging of cardiac in each group

2.6 各組心肌血管數(shù)量比較 各組心肌血管數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中對(duì)照2組心肌血管數(shù)量多于對(duì)照1組，對(duì)照3組心肌血管數(shù)量多于對(duì)照1組、少于對(duì)照2組，BMSCs組、空載體-BMSCs組心肌血管數(shù)量多于對(duì)照1組、少于對(duì)照2組和對(duì)照3組，過(guò)表達(dá)GATA-4-BMSCs組心肌血管數(shù)量多于對(duì)照1組、少于對(duì)照2組和對(duì)照3組、多于BMSCs組和空載體-BMSCs組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表3、圖4）。

2.7 各組小鼠C-kit陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比較 各組小鼠C-kit陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中對(duì)照2組、對(duì)照3組C-kit陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量少于對(duì)照1組，BMSCs組、空載體-BMSCs組C-kit陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照1組、對(duì)照2組和對(duì)照3組，過(guò)表達(dá)GATA-4-BMSCs組C-kit陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照1組、對(duì)照2組、對(duì)照3組、BMSCs組、空載體-BMSCs組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表4、圖5）。

表3 各組小鼠心肌血管數(shù)量比較（x±s，個(gè)/高倍鏡）Table 3 Comparison of number of myocardial vessels in each group

表4 各組小鼠C-kit陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比較（x±s，個(gè)/高倍鏡）Table 4 Comparison of number of C-kit positive cells in each group

3 討論

GATA結(jié)合蛋白是具有Ⅳ型鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。最近有研究表明，在房間隔缺損患者中，特別容易觀察到GATA-4的C末端鋅指結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；而此區(qū)域是DNA連接區(qū)，也是協(xié)同分子作用的區(qū)域，而DNA連接區(qū)域的改變也引發(fā)了轉(zhuǎn)錄活動(dòng)的下降［2］。脊椎動(dòng)物有兩類GATA結(jié)合蛋白，其中，GATA-1/2/3參與造血系統(tǒng)調(diào)控；GATA-4/5/6參與心臟、腸及外胚組織中的基因表達(dá)調(diào)控。GATA-4是調(diào)控心臟基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，參與心臟正常發(fā)育、功能基因表達(dá)和心肌肥大的病理過(guò)程。而GATA-4在心臟發(fā)育的早期起重要作用，抑制其表達(dá)，可阻斷p19畸胎瘤細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，強(qiáng)表達(dá)則增強(qiáng)心肌分化［3］。通過(guò)采取反義策略，對(duì)GATA-4進(jìn)行剔除可阻止前體心臟細(xì)胞的分化，而利用功能增益方法刺激GATA-4的表達(dá)可誘導(dǎo)出現(xiàn)異位收縮的心肌細(xì)胞，因此，表明GATA-4可介導(dǎo)心肌的分化、增殖和存活［4］。

本實(shí)驗(yàn)基于上述研究通過(guò)向小鼠BMSCs轉(zhuǎn)染GATA-4，進(jìn)而增強(qiáng)BMSCs修復(fù)心肌損傷的能力。本研究結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)GATA-4-BMSCs組在給予干預(yù)措施72 h后，EF及FS差值改善幅度最大，可以更好地改善心功能，且心臟區(qū)域熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，說(shuō)明GATA-4-BMSCs具有更強(qiáng)的“歸巢”效應(yīng)。

圖4 番茄凝集素評(píng)估各組心肌血管數(shù)量（×100）Figure 4 The number of myocardial vessels in each group by tomato lectin

圖5 免疫組化評(píng)估各組C-kit陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量（免疫組化，×400）Figure 5 The number of C-kit positive cells in each group by immunohistochemistry

番茄凝集素與存在灌流的血管內(nèi)皮細(xì)胞上的N-乙酰葡糖胺低聚物結(jié)合，因此可直接標(biāo)記有灌流的血管，而無(wú)灌注的血管不會(huì)被標(biāo)記。因此定量番茄凝集素標(biāo)記的血管數(shù)量提供了一種直接測(cè)量心肌灌注功能的方法。由于GATA-4具有促進(jìn)心血管發(fā)育的作用［5-6］，本研究在完成心臟彩超后開(kāi)腹經(jīng)下腔靜脈注射番茄凝集素，采用熒光共聚焦顯微鏡檢查心肌血管數(shù)量。結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)GATA-4-BMSCs組表達(dá)出更多的血管。

心肌干細(xì)胞（cardiac stem cells，CSC）是TORELLA等［7］從老鼠心臟中分離出的一種固有CSCs。隨后MESSINA等［8］報(bào)道成體心臟含有心臟干/祖細(xì)胞，如：C-kit+［9］、SCA-1+［10］、ISL-1+ 和邊緣細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采用C-kit作為標(biāo)志性分子，評(píng)估GATA-4動(dòng)員心肌梗死局部C-kit陽(yáng)性細(xì)胞的能力。結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)GATA-4-BMSCs組C-kit陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量多于其他組。

綜上所述，過(guò)表達(dá)GATA-4-BMSCs可以通過(guò)增強(qiáng)“歸巢”效應(yīng)、促進(jìn)心肌梗死局部血管增生、有效動(dòng)員C-kit陽(yáng)性細(xì)胞修復(fù)心肌損傷。

作者貢獻(xiàn)：賀繼剛、嚴(yán)丹進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理、結(jié)果的分析與解釋、論文修訂、負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校、對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；賀繼剛、韓金秀進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析、撰寫論文；韓金秀、李貝貝、李宏遠(yuǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；賀繼剛、李洪榮進(jìn)行數(shù)據(jù)整理。

本文無(wú)利益沖突。

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