程宏??

摘要：對(duì)“pH對(duì)酶活性的影響”探究實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)方案、操作步驟、實(shí)驗(yàn)拓展的充分思考與設(shè)計(jì)更有利于探究活動(dòng)的科學(xué)、開放和深入。

關(guān)鍵詞：pH；酶活性；過氧化氫；過氧化氫酶

研究背景

影響酶活性的條件很多，其中“pH對(duì)酶活性的影響”就是高中生物中學(xué)生需要探究的一個(gè)主題。如果僅僅按照常規(guī)的教學(xué)安排，將使得探究實(shí)驗(yàn)成為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)或者僅僅是操作技術(shù)的模仿。如何使得整個(gè)探究活動(dòng)更為科學(xué)、開放和深入呢？筆者在實(shí)際的教學(xué)中有以下探究與思考：

教學(xué)設(shè)計(jì)

一、 課前分組設(shè)計(jì)“探究pH對(duì)酶活性的影響”實(shí)驗(yàn)方案

實(shí)驗(yàn)材料：過氧化氫溶液、過氧化氫酶溶液（動(dòng)植物組織提取液）、淀粉溶液、淀粉酶溶液。

實(shí)驗(yàn)器材：滿足方案需求。

二、 課上分組交叉討論實(shí)驗(yàn)方案，關(guān)注以下幾個(gè)主題

1. 選擇什么樣的實(shí)驗(yàn)材料更合適？

實(shí)驗(yàn)中需要加入鹽酸和氫氧化鈉以調(diào)節(jié)pH值，那么毫無疑問，需要考慮pH（酸堿度）對(duì)反應(yīng)底物分解的影響，按照教材中的建議，“用過氧化氫酶探究pH對(duì)酶活性的影響”而不采用“淀粉酶”。原因是淀粉會(huì)在酸性條件下進(jìn)行水解，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，干擾對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，無法作出“pH對(duì)酶活性影響”的相關(guān)結(jié)論。

2. 如何設(shè)定合適的梯度區(qū)間？

那么，使用過氧化氫酶（CAT）探究pH對(duì)酶活性的影響是不是就不用考慮pH對(duì)過氧化氫分解的影響了呢？教師演示實(shí)驗(yàn)：向過氧化氫溶液中添加強(qiáng)酸強(qiáng)堿，觀察現(xiàn)象。

過氧化氫是一種二元弱酸，金屬過氧化物是它的正鹽。

實(shí)驗(yàn)室制取過氧化氫就是利用強(qiáng)酸制弱酸原理：

H2SO4+BaO2H2O2+BaSO4↓

過氧化氫在強(qiáng)酸性條件下（pH<3）穩(wěn)定性較差，表現(xiàn)很強(qiáng)的氧化性，能夠使得蛋白質(zhì)分子的氨基酸殘基被氧化。如，半胱氨酸的巰基容易被氧化，如果酶的活性位點(diǎn)是半胱氨酸，氧化后則失活，如果其他位置的半胱氨酸被氧化，則形成其他二硫鍵影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。

過氧化氫在弱酸條件下比較穩(wěn)定，一般商品的過氧化氫溶液里都加有酸作為穩(wěn)定劑，它的pH值約在4左右。當(dāng)pH值在5～7時(shí)，其分解有所加快。

過氧化氫在強(qiáng)堿性條件下不穩(wěn)定，表現(xiàn)為還原性，分解速度加快。因?yàn)樵诖藯l件下，容易形成HO-2離子。而HO-2是一種親核試劑，會(huì)繼續(xù)引發(fā)過氧化氫分解。其反應(yīng)如下：

H2O2H++HO-2

當(dāng)pH>11時(shí)過氧化氫分子大部分以過氧氫陰離子（HO-2）形式存在，所以此時(shí)溶液的穩(wěn)定性很差，且隨著pH值的升高，穩(wěn)定性下降，分解速度更快。

因此，如果用過氧化氫酶探究pH對(duì)酶活性的影響就需要對(duì)pH的范圍進(jìn)行設(shè)定，不要過酸或者過堿，從而針對(duì)性地探究出pH對(duì)酶活性的影響。

3. 用三種實(shí)驗(yàn)操作方法的差別到底是控制無關(guān)變量還是自變量？

搜集學(xué)生的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，分析比較各方案的差異：

方案一：向3支盛有酶溶液的試管中加入已經(jīng)稀釋待用的鹽酸溶液（pH為4、5、6）2mL，充分混勻后，各自加入2mL過氧化氫溶液，振蕩，觀察比較氣泡的產(chǎn)生速率。

方案二：先將酶溶液加入過氧化氫溶液中，在酶和底物的反應(yīng)體系中快速加入已經(jīng)稀釋待用的鹽酸溶液（pH為4、5、6）2mL，振蕩，觀察比較氣泡的產(chǎn)生速率。

方案三：向3支盛有酶溶液的試管和3支盛有底物溶液的試管中分別加入已經(jīng)稀釋待用的鹽酸溶液（pH為4、5、6）2mL，充分混勻后，將兩支試管的內(nèi)容物混合在一起，觀察比較氣泡的產(chǎn)生速率。

對(duì)于方案一來說，雖然過氧化氫酶被不同pH處理過，但是當(dāng)過氧化氫酶溶液與過氧化氫溶液混合時(shí)，pH已經(jīng)明顯發(fā)生改變。在未知pH對(duì)酶活性影響是否具有可逆性時(shí)，這種做法是違背控制性原則的。

由于酶具有高效性，方案二中，氣泡的產(chǎn)生速率很快，加入不同pH的鹽酸溶液已經(jīng)看不出明顯差異。

只有方案三，由于底物與酶分別處理，所以很好地控制了pH誤差，pH是本實(shí)驗(yàn)的自變量，而不是無關(guān)變量。操作方法體現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)者對(duì)實(shí)驗(yàn)自變量的操控而不是對(duì)無關(guān)變量的控制。

三、 課堂分組實(shí)施實(shí)驗(yàn)方案，圍繞操作與裝置提出問題

1. 可以用梯度稀釋法配制不同pH的鹽酸溶液

借鑒微生物分離純化與計(jì)數(shù)中的“梯度稀釋”方法可以獲得不同濃度梯度NaOH溶液和HCl溶液，具體方法是：用微量移液器吸取1mL的濃鹽酸，加入盛有11mL蒸餾水的1號(hào)試管中，振蕩混勻，此時(shí)溶液pH為3；更換槍頭，在1號(hào)試管中吸取1mL的溶液，加入盛有9mL蒸餾水的2號(hào)試管中，振蕩混勻，此時(shí)溶液pH為4；以此類推可以配制溶液pH為5、6的鹽酸溶液（注意不能配制得到pH為7的溶液，直接使用蒸餾水）。

2. 反應(yīng)的觀測(cè)指標(biāo)是什么？酶促反應(yīng)速率就是酶活性嗎？

無論是觀察氣泡的釋放速度，還是觀察有色液滴的移動(dòng)距離，以這些為標(biāo)準(zhǔn)，衡量酶促反應(yīng)速率。但是酶促反應(yīng)速率并不等同于酶活性。酶活性是酶的一個(gè)屬性，影響酶活性的因素一定影響酶促反應(yīng)速率，比如溫度、pH、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。反之，影響酶促反應(yīng)速率的因素不一定影響酶活性，比如酶濃度、底物濃度。

四、 課后反思實(shí)驗(yàn)拓展

1. 這個(gè)實(shí)驗(yàn)究竟能不能找到“最適”呢？

嚴(yán)格地說，通過具體的實(shí)驗(yàn)是不能夠找到所謂“最適”的，即使很小的梯度范圍。但是，我們可以確定“通過該實(shí)驗(yàn)得到的最適”或者“最適的區(qū)間”。

2. 為什么肝臟研磨液可以催化過氧化氫的分解呢？

在真核細(xì)胞中普遍存在著過氧化物酶體（微體），在肝細(xì)胞和腎細(xì)胞中數(shù)量特別多。過氧化物酶體含有豐富的酶類，主要是氧化酶、過氧化氫酶。其中的氧化酶可以催化過氧化氫的產(chǎn)生，過氧化氫酶是過氧化物酶體的標(biāo)志酶，能夠催化過氧化氫的分解，從而使細(xì)胞免受過氧化氫的毒害。

3. pH是怎樣影響酶活性的？可以恢復(fù)嗎？

pH影響酶活性的原因可用以下兩個(gè)方面加以理解：

（1）過酸、過堿可以破壞酶的空間結(jié)構(gòu)，使酶失活，這樣的破壞是不可逆轉(zhuǎn)的；

（2）當(dāng)pH改變不是很劇烈時(shí)，pH造成影響可以這么分析：

①影響底物的解離狀態(tài)，使底物不能和酶結(jié)合或者結(jié)合以后不能生成產(chǎn)物；

②影響酶活性部位有關(guān)基團(tuán)的解離，從而影響與底物的結(jié)合或催化；各種酶在維持最適pH時(shí)所處的某種解離狀態(tài)，最有利于與底物結(jié)合并發(fā)生催化，如膽堿酯酶解離成兩性離子、精氨酸酶呈負(fù)離子時(shí)活力最大；

③影響到中間產(chǎn)物ES的解離狀態(tài)，不利于催化產(chǎn)物生成。

在相對(duì)微小的范圍中，pH對(duì)酶活性造成的影響是可以恢復(fù)的，正像酸堿緩沖劑中提取或保存酶溶液是一個(gè)共識(shí)的道理一樣。

4. 對(duì)于無關(guān)變量的控制“相同、等量”且“適宜”是否需要“預(yù)實(shí)驗(yàn)”？

事實(shí)上，溫度對(duì)過氧化氫酶的活性是有非常大的影響的，不同溫度條件下得到的結(jié)果是有差異的。好在過氧化氫酶在本地室溫（實(shí)驗(yàn)室夏季最高28℃，冬季22℃）下都能夠很好地發(fā)揮作用，因此一般并沒有進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。但值得注意的是，如果多個(gè)無關(guān)變量影響著實(shí)驗(yàn)結(jié)果的話，就需要逐一找到“適宜”，比如：酶濃度、底物濃度等等。

參考文獻(xiàn)：

[1]汪堃仁.細(xì)胞生物學(xué).北京：高等教育出版社，1991.

[2]翟中和.細(xì)胞生物學(xué).北京：高等教育出版社，2001.

作者簡(jiǎn)介：

程宏，安徽省黃山市，歙縣長(zhǎng)青中學(xué)。endprint