王 娜

（北京衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，北京100053）

結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis）俗稱結(jié)核桿菌，是結(jié)核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺臟最多見。據(jù)統(tǒng)計，全世界有1/3的人口感染結(jié)核分枝桿菌。據(jù)WHO報道，每年約有800萬新增病例，至少有300萬人死于肺結(jié)核，肺結(jié)核已成為醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)重要的教學(xué)內(nèi)容[1]?？顾崛旧ㄊ菣z驗結(jié)核分枝桿菌的常規(guī)方法，該法于1882年由埃利F Ehrlich首創(chuàng)，經(jīng)F·齊爾改進。其中最具代表性的為齊—尼氏染色法和齊爾—加貝特（Ziehl-Gabbet）染色法[2]。目前，抗酸染色法已被廣泛應(yīng)用于臨床，結(jié)核分枝桿菌的抗酸染色法是醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)學(xué)生必學(xué)、必會的內(nèi)容。

1 研究原因

結(jié)核分枝桿菌傳染性極強，傳播途徑主要有呼吸道、消化道、皮膚和子宮。排菌期肺結(jié)核病人的痰液干燥后，細(xì)菌隨塵土飛揚，被他人吸入而引起感染。人體吸入含有結(jié)核分枝桿菌的飛沫是否患病主要與吸入細(xì)菌的數(shù)量、毒力、自身抵抗力等多種因素有關(guān)，可累及全身多個器官、系統(tǒng)，最常見的部位是肺臟（占80%～90%)，也可累及肝、腎、腦、淋巴結(jié)等器官。由于實驗室人員密度大、學(xué)生生物安全意識淡薄、自我保護能力差等，增加了實驗教學(xué)的生物安全隱患。加之病人痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌含量不定，甚至還會有陰性標(biāo)本，所以實驗課上常會出現(xiàn)檢出率低的情況，無法達到預(yù)期教學(xué)效果。《傳染病防治法》《醫(yī)院感染管理辦法》《醫(yī)療機構(gòu)管理條例》《突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急條例》等法律法規(guī)規(guī)定，醫(yī)院對臨床標(biāo)本應(yīng)嚴(yán)格管理，不得外漏，故學(xué)校獲取痰標(biāo)本的難度非常大。

2 模擬痰標(biāo)本抗酸染色法

為達到既讓學(xué)生學(xué)到知識，又保證師生安全的目的，我們經(jīng)過多次實驗，找到利用模擬痰標(biāo)本進行抗酸染色教學(xué)的方法，具體如下。

2.1 抗酸染色的原理

結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁含有大量脂質(zhì)（主要是分枝菌酸），它包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般不易著色，需要經(jīng)過加熱和延長染色時間來促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結(jié)合后，很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。齊—尼氏染色法是在加熱條件下使分枝菌酸與石炭酸復(fù)紅牢固結(jié)合成復(fù)合物，用鹽酸酒精處理也不脫色。再加入堿性美蘭復(fù)染后，分枝桿菌仍然為紅色，而其他細(xì)菌及背景中的物質(zhì)則為藍(lán)色。

2.2 模擬痰標(biāo)本片的制備

2.2.1 材料（1）取10 ml正常人痰液，加入40 ml生理鹽水,混勻。（2）卡介苗1支（0.75 mg/ml）。

2.2.2 模擬痰標(biāo)本制備方法 用注射器將卡介苗吸出，注入50 ml正常人痰液中，制備成痰懸液，采用高壓蒸汽滅菌法（103.4 kpa，121.3℃）滅菌 30 min。

2.2.3 涂片 所需物品：滅菌滴管、載玻片。涂片方法：（1）在干凈的載玻片上用玻璃蠟筆做好標(biāo)記，以便分清正反面。（2）用滅菌滴管取痰懸液1滴，置于載玻片中央，制成1.0 cm×1.0 cm大小的均勻薄涂片。（3）將涂片置于通風(fēng)干燥處，自然干燥即可。（4）火焰固定痰涂片。

2.3 抗酸染色步驟

2.3.1 初染 將已固定的痰涂片置于染色架上或用染色夾子夾住，滴加石炭酸復(fù)紅染液2～3滴，在火焰上方徐徐加熱，切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽時移開，若染液蒸發(fā)減少，及時添加，加熱3～5 min，待標(biāo)本冷卻后用水沖洗。

2.3.2 脫色 以3%鹽酸酒精脫色，直至涂片已無紅色染液脫下為止（不可超過10min），用水沖洗。

2.3.3 復(fù)染 滴加堿性美蘭溶液蓋滿痰膜，復(fù)染1 min，之后用水沖洗，再用吸水紙吸干。

2.4 鏡檢

在淡藍(lán)色背景下，抗酸桿菌（結(jié)核分枝桿菌）呈紅色，非抗酸菌及細(xì)胞等均呈藍(lán)色，鏡檢結(jié)果見表1。

表1 鏡檢結(jié)果

3 模擬痰標(biāo)本與真正痰標(biāo)本的陽性檢出率比較

我校于2015年第二學(xué)期對模擬痰標(biāo)本在抗酸染色實驗教學(xué)中的應(yīng)用效果進行研究，并進入試驗階段，2016年正式使用。本文數(shù)據(jù)統(tǒng)計時間為2014年3月至2017年6月，共7個學(xué)期，涉及11個班級。利用模擬痰標(biāo)本進行抗酸染色實驗教學(xué)后，結(jié)核分枝桿菌陽性檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以往使用真正的痰標(biāo)本的陽性檢出率，具體見表2。

4 模擬痰標(biāo)本的優(yōu)點

4.1 生物安全有保證

教學(xué)安全是保證教學(xué)效果的第一要素，只有保證了安全才能談效果。實驗教師要消除各種安全隱患，為學(xué)生創(chuàng)造一個安全、貼近臨床的實驗環(huán)境。模擬痰標(biāo)本是利用卡介苗制備的，且經(jīng)過高壓蒸汽滅菌法滅菌，能夠最大限度保證師生安全，消除實驗安全隱患。

表2 模擬痰標(biāo)本與真正痰標(biāo)本陽性檢出率比較

4.2 陽性檢出率高，提升了實驗教學(xué)效果

提升教學(xué)效果是實驗教學(xué)的最終目的。使用模擬痰標(biāo)本后，學(xué)生檢出的抗酸桿菌含量均在兩個加號以上，形態(tài)典型，且可以通過控制卡介苗的濃度進行調(diào)節(jié)，不僅做到靈活教學(xué)，而且使學(xué)生牢固掌握結(jié)核分枝桿菌的形態(tài)特點，避免未來實習(xí)和工作中出現(xiàn)漏檢等問題。

[1]全國衛(wèi)生專業(yè)技術(shù)資格考試專家委員會.2017全國衛(wèi)生專業(yè)技術(shù)資格考試指導(dǎo)：臨床醫(yī)學(xué)檢驗與技術(shù)（中級）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2017.

[2]倪語星，尚紅.臨床微生物學(xué)檢驗[M].5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013.

[3]支明玉.微生物檢驗技術(shù)與實訓(xùn)指導(dǎo)[M].北京：中國勞動社會保障出版社，2014.