羅吉+李勇敏+簡小蘭+羅燕+譚小寧+蔣益蘭

摘要：目的 觀察健脾消癌方對轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）誘導(dǎo)的SW620細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，探討其防治結(jié)直腸癌的可能機制。方法 體外培養(yǎng)結(jié)直腸癌細胞SW620。CCK-8法和Transwell小室實驗測定細胞增殖、侵襲及遷移能力，qRT-PCR和Western blot檢測E-cadherin和Vimentin的基因和蛋白表達。結(jié)果 健脾消癌方藥物血清能抑制SW620細胞體外增殖、遷移和侵襲能力；與空白組比較，TGF-β1誘導(dǎo)組細胞E-cadherin表達水平下降，Vimentin表達水平升高（P<0.05）；與TGF-β1誘導(dǎo)組比較，健脾消癌方+TGF-β1組細胞E-cadherin表達水平升高，Vimentin表達水平下降（P<0.05）。結(jié)論 健脾消癌方可通過調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的SW620細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，抑制結(jié)腸癌的生長、侵襲和遷移能力，達到防止結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的目的。

關(guān)鍵詞：健脾消癌方；結(jié)直腸癌；腫瘤轉(zhuǎn)移；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.010

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）02-0042-05

Effects of Jianpi Xiaoai Prescription on Epithelial-mesenchymal Transition of

Colorectal Cancer Cell SW620 Induced by TGF-β1

LUO Ji1， LI Yong-min1， JIAN Xiao-lan2， LUO Yan1， TAN Xiao-ning1， JIANG Yi-lan1

1. Affiliated Hospital of Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha 410006， China；

2. Graduate School of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China

Abstract： Objective To observe the effects of Jianpi Xiaoai Prescription on epithelial-mesenchymal transition of colorectal cancer cell SW620 induced by TGF-β1； To discuss its possible mechanism of action for prevention and treatment of colorectal cancer. Methods Colorectal cancer cells SW620 were cultured in vitro. By conducting CCK-8 and Transwell experiments， the proliferation， invasion and migration of colorectal cancer cell （SW620） were detected. qRT-PCR and Western blot experiments were applied to verify the mRNA and protein expression level of E-cadherin and Vimentin. Results Jianpi Xiaoai Prescription showed in vitro inhibitory effect on the proliferation， invasion and migration of colorectal cancer cell SW620. Compared with blank group， the expression of E-cadherin in TGF-β1 induced group was reduced and Vimentin was increased （P<0.05）； Meanwhile， the expression of E-cadherin in Jianpi Xiaoai Prescription group was increased and Vimentin was decreased when compared with TGF-β1 induced group （P<0.05）. Conclusion Jianpi Xiaoai Prescription can inhibit the proliferation， invasion and migration of colorectal cancer cell by reverting the epithelial-mesenchymal transition of colorectal cancer cell induced by TGF-β1， with a purpose to achieve the goal of preventing and treating the recurring and migration of colorectal cancer.

Keywords： Jianpi Xiaoai Prescription； colorectal cancer； metastasis； epithelial-mesenchymal transition

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是臨床常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率位居消化道惡性腫瘤的第2位[1]。本課題組既往研究表明，健脾消癌方配合化療能顯著降低大腸癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，控制瘤體的生長，延長患者生存期，提高患者生存質(zhì)量；能抑制結(jié)直腸癌裸鼠模型的肝轉(zhuǎn)移率，但其具體作用機制還不甚清楚[2-4]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithlial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞在特定的生理和病理情況下向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，被公認為影響CRC侵襲和轉(zhuǎn)移的重要作用機制之一。在EMT過程中，上皮細胞標志蛋白E-cadeherin表達下調(diào)及間質(zhì)細胞標志蛋白Vimentin表達上調(diào)，從而導(dǎo)致細胞極性發(fā)生改變、細胞骨架被重建、細胞間黏附出現(xiàn)不同程度的喪失以及腫瘤基底膜和細胞外基質(zhì)均被不同程度破壞，從而使細胞獲得高遷移、高侵襲、抗凋亡及降解細胞外基質(zhì)等間質(zhì)表型特征[5]。本實驗采用轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）誘導(dǎo)的CRC細胞SW620發(fā)生EMT，建立大鼠細胞EMT模型，探究健脾消癌方對SW620細胞EMT的作用及其抗腫瘤細胞遷移侵襲的可能機制。endprint

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級SD大鼠20只，7～8周齡，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，湖南省長沙斯萊克實驗動物中心，動物合格證號SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)于溫度（20±1）℃、相對濕度50%～70%環(huán)境，光照12 h/12 h明暗交替，自由攝食飲水。

1.2 細胞

SW620細胞，中國科學(xué)院上海細胞中心，培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和鏈霉素的DMEM（高糖）培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司），胎牛血清（GIBCO公司），CCK-8（同仁化學(xué)研究所），PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara），SYBR-Green master（ROCHE），蛋白免疫印跡常規(guī)試劑（上海碧云天生物研究公司），E-cadherin、Vimentin一抗（Abcam公司），β-actin一抗（SIGMA公司），二抗抗體（中杉金橋公司）。細胞培養(yǎng)箱（Thermo公司），EIX808U型全自動酶標儀（BioTek），Hoefer SE300電泳，凝膠成像系統(tǒng)（Syngene），實時熒光定量PCR儀（ROCHE 480）。

1.4 健脾消癌方藥物血清制備

健脾消癌方（人參10 g，薏苡仁30 g，重樓10 g，半枝蓮30 g，莪術(shù)10 g，郁金15 g），飲片購自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房。將2倍量處方藥物用溫水浸泡1 h，水量超出藥物5～6 cm，大火煮沸后轉(zhuǎn)小火煎30 min，趁熱過濾，藥渣再煎煮2次，將3次藥液混勻、過濾，減壓濃縮為含1.5 g原藥材/mL，4 ℃保存，1周內(nèi)用完。實驗大鼠隨機編號分為對照組和實驗組，每組10只。實驗組按相當于70 kg成人120 g/d的藥物量（10.8 g/kg）灌胃；對照組按大鼠體質(zhì)量灌胃等體積生理鹽水。每日1次，連續(xù)6 d，于第7日最后1次灌胃后l h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，腹主動脈取血，4 ℃保存，2000 r/min離心10 min，吸取血清，合并同組動物血清，0.22 μm微孔濾膜過濾，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期SW620細胞，調(diào)整細胞數(shù)目為5×104/mL，按100 μL/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)基，給予10%、15%、20%藥物血清，10%、15%、20%空白血清，并設(shè)置陰性對照組（10%、15%、20%FBS），用培養(yǎng)基進行調(diào)零，每組5個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入CCK8試劑10 μL，37 ℃孵育1.5 h，于酶標儀波長450 nm處測定OD值，計算細胞增殖抑制率[（對照組OD值-實驗組OD值）÷對照組OD值×100%]。

1.6 分組

選擇對數(shù)生長期的SW620細胞，按5×105/孔接種于60 mm培養(yǎng)皿中，每皿6 mL培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中過夜，次日更換新鮮培養(yǎng)基。實驗分為空白對照組（DMEM培養(yǎng)基6 mL+15%空白血清）、TGF-β1組（含TGF-β1 10 ng/mL的DMEM培養(yǎng)基6 mL+15%空白血清）、TGF-β1+健脾消癌方組（含TGF-β1 10 ng/mL的DMEM培養(yǎng)基6 mL+15%健脾消癌方藥物血清），每組設(shè)置3個重復(fù)，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

1.7 細胞侵襲、遷移實驗

應(yīng)用Transwell小室（孔徑8 μm）進行侵襲實驗。首先制備含Matrigel膠的Transwell小室。實驗預(yù)處理各組細胞：空白對照組（DMEM培養(yǎng)基6 mL+15%空白血清）、TGF-β1組（含TGF-β1 10 ng/mL的DMEM培養(yǎng)基6 mL+15%空白血清）、TGF-β1+健脾消癌方組（含TGF-β1 10 ng/mL的DMEM培養(yǎng)基6 mL+15%健脾消癌方藥物血清），處理48 h，收集細胞，PBS清洗3次。用單DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至1×106/mL，100 μL/孔接種于Transwell小室的上室，空白組小室下室加入含15%FBS的DMEM 1 mL作為誘導(dǎo)劑。細胞37 ℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出小室，洗滌后甲醇固定20 min，風(fēng)干，0.1%結(jié)晶紫染液染色20 min，顯微鏡下觀察穿過小室的細胞數(shù)，拍照，計數(shù)。遷移實驗除不在小室鋪膠外，其余步驟同侵襲實驗。

1.8 Western blot檢測蛋白表達

各組細胞分別培養(yǎng)48 h，蛋白裂解液（強）提取總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白質(zhì)濃度。取40 μg/孔蛋白進行10%SDS-PAGE分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，5%BSA室溫封閉2 h，分別加入適量稀釋后抗體E-cadherin（1∶10 000）、Vimentin（1∶1000）、β-actin（內(nèi)參，1∶10 000），4 ℃搖床合適搖速孵育過夜；吐溫與三乙醇胺緩沖鹽水溶液（TBST）洗滌3次，分別加入相應(yīng)二抗山羊抗兔（1∶5000）、山羊抗小鼠（1∶5000），室溫搖床合適搖速孵育1 h，TBST洗滌3次，加入適量增強化學(xué)發(fā)光法（ECL）發(fā)光試劑，暗室內(nèi)曝光顯影，圖像分析。

1.9 qRT-PCR檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換相關(guān)蛋白E-cadherin和Vimentin基因表達

各組細胞分別培養(yǎng)48 h，酚-氯仿法提取各組細胞總RNA，瓊脂糖凝膠電泳以及紫外分光光度儀測定RNA的完整性，各組樣品吸光度比值均在1.8～2.1。按試劑盒說明書進行總RNA反轉(zhuǎn)錄實驗，反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃、30 min；98 ℃、5 min；-20 ℃保存。再以cDNA為模板，與基因特異性引物PCR擴增E-cadherin和Vimentin。擴增后對解離曲線進行分析，確保只有單一產(chǎn)物被擴增。最終進行測定分析。實驗重復(fù)3次。內(nèi)參基因為GAPDH，引物序列見表1，引物均由上海生物工程有限公司合成。E-cadherin和Vimentin的mRNA表達以GAPDG作為內(nèi)參照，ΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt最低樣本-ΔCt其他樣本，以2-ΔΔCt值表示。endprint

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，滿足正態(tài)分布組間比較用t檢驗，多組間比較方差齊用方差分析、方差不齊用秩和檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健脾消癌方對SW620細胞增殖的影響

與對照組（10%、15%、20%空白血清）比較，健脾消癌方藥物血清對SW620細胞體外生長有明顯的抑制作用，且呈濃度與時間依賴性。健脾消癌方藥物血清處理SW620細胞24 h，15%、20%藥物血清對SW620細胞的生長都具有抑制作用，其中15%藥物血清濃度處理24 h，對細胞的生長抑制率為18%，處理48 h的生長抑制率達到32%；而20%健脾消癌方藥物血清處理24 h，對細胞的生長抑制率為29%，處理48 h后的生長抑制率則達到56%。結(jié)果見圖1。

2.2 健脾消癌方對SW620細胞遷移能力的影響

與空白組比較，TGF-β1誘導(dǎo)組進入小室膜下SW620細胞明顯增多（P<0.05），健脾消癌方能明顯減少進入小室膜下方經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)的SW620細胞（P<0.05），且空白組與TGF-β1+健脾消癌方組比較無明顯差異（P>0.05）。結(jié)果見圖2。

2.3 健脾消癌方對SW620細胞侵襲能力的影響

與空白組比較，TGF-β1誘導(dǎo)組能使穿透小室膜進入其下方的SW620細胞明顯增多（P<0.05），而健脾消癌方能明顯減少進入小室下方的經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)的SW620細胞（P<0.05），且空白組與TGF-β1+健脾消癌方組比較無明顯差異（P>0.05）。結(jié)果見圖3。

2.4 健脾消癌方對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換相關(guān)蛋白E-cadherin和Vimentin mRNA表達的影響

與空白組比較，TGF-β1誘導(dǎo)組細胞上皮標志蛋白E-cadherin mRNA表達明顯降低，間質(zhì)標志蛋白Vimentin mRNA表達明顯升高（P<0.05）；與TGF-β1誘導(dǎo)組比較，TGF-β1+健脾消癌方組細胞E-cadherin mRNA表達上調(diào)，Vimentin mRNA表達明顯降低（P<0.05）。結(jié)果見圖4。

2.5 健脾消癌方對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換相關(guān)蛋白E-cadherin和Vimentin蛋白表達的影響

與空白組比較，TGF-β1誘導(dǎo)組細胞上皮標志蛋白E-cadherin蛋白表達明顯降低，間質(zhì)標志蛋白Vimentin蛋白表達明顯升高（P<0.05）；與TGF-β1誘導(dǎo)組比較，TGF-β1+健脾消癌方組細胞E-cadherin蛋白表達上調(diào)，Vimentin蛋白表達明顯降低（P<0.05）。結(jié)果見圖5。

3 討論

健脾消癌方是蔣益蘭教授根據(jù)其多年臨床經(jīng)驗總結(jié)，以健脾益氣、化瘀解毒為法創(chuàng)制的用于治療結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的方劑。我們以往的實驗研究表明，健脾消癌方能有效抑制結(jié)直腸癌裸鼠的肝轉(zhuǎn)移率，其機制可能是通過抑制金屬基質(zhì)蛋白酶-9的蛋白表達而發(fā)揮作用，但對其是否可以調(diào)控結(jié)腸癌細胞的EMT行為還知之甚少[6]。

研究表明，結(jié)直腸上皮細胞發(fā)生EMT是結(jié)直腸癌生長與轉(zhuǎn)移的重要因素，結(jié)直腸癌細胞發(fā)生EMT會使自身侵襲性、抗凋亡能力及耐藥性增強，有利于腫瘤細胞的局部浸潤和遠端轉(zhuǎn)移，加快結(jié)直腸癌的發(fā)展進程[5]。抑制結(jié)腸癌細胞EMT發(fā)生可作為研發(fā)抗結(jié)腸癌藥物的一個重要方向。趙汝楠等[7]研究發(fā)現(xiàn)，蟾毒靈作為抗腫瘤藥物華蟾素中的重要生物學(xué)活性成分，具有明顯的抑制結(jié)腸癌細胞生長增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡和抑制腫瘤細胞遷移等作用，其機制可能是通過阻止結(jié)腸癌細胞的EMT而發(fā)揮其抑制作用。

TGF-β1是TGF-β家族中的重要因子之一，在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中被證實為細胞EMT的重要誘導(dǎo)因子，與腫瘤的增殖、分化、遷移和侵襲密切相關(guān)。腫瘤細胞膜上TGF-β受體與TGF-β1因子結(jié)合后，可以激活TGF-β受體，使其細胞內(nèi)靶標蛋白smad2和samd3發(fā)生磷酸化，再與smad4蛋白結(jié)合，抑制上皮標志蛋白E-cadherin的表達和促進間質(zhì)標志蛋白Vimentin的表達，最終使上皮細胞極性受到破壞，細胞與細胞之間的連接變得松散，從而發(fā)生腫瘤細胞的侵襲和遷移[8-10]。本實驗結(jié)果表明，健脾消癌方能顯著抑制結(jié)直腸細胞的增殖、遷移和侵襲，并呈明顯的劑量依賴性，其作用機制與抑制結(jié)腸癌細胞的EMT過程密切相關(guān)，我們還發(fā)現(xiàn)，健脾消癌方可明顯抑制TGF-β1因子所誘導(dǎo)的EMT，顯著誘導(dǎo)上皮標志蛋白E-cadherin的表達，下調(diào)Vimentin的表達，維持細胞間緊密的連接，從而防止腫瘤細胞發(fā)生遷移和轉(zhuǎn)移，其具體分子機制有待進一步研究。

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