劉彩霞, 焦如珍, 趙京京

1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所, 北京 100091; 2.湖南省林業(yè)科學(xué)院, 長(zhǎng)沙 410004

林木是森林資源中最重要的組成部分，隨著人工林面積的增加和純林化程度的提高，林木的病害種類逐漸增多，其危害程度也日益加重[1]。在林木的種植過程中做好病害防治工作是保證林木經(jīng)濟(jì)效益的重要前提。在林業(yè)生產(chǎn)中，常見的林木病害有苗木尖枯病、林木縮頂病、赤枯病、炭疽病、苗木猝倒病、葉枯病、潰瘍病等[2]，而引起以上病害的主要病原菌有尖孢鐮刀菌(FusariumoxysporumSchltdl.)、擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsisapiculatus(Huang.) Huang)、膠孢炭疽菌(ColletotrichumgloeosporiodesPenz.)、腐皮鐮孢菌(FusariumsolaniSacc)、杉葉散斑殼(LophodermiumuncinatumDarker)、杉葡萄座殼(BotryosphaeriacunninghamiaeHuang sp.)等[3,4]。這些病原菌不具有寄主專一性，常導(dǎo)致多種植物發(fā)生病害。

林木病害的調(diào)控原則主要是預(yù)防為主、防治結(jié)合。在眾多防治手段中，生物防治因同時(shí)滿足林業(yè)發(fā)展及生態(tài)文明建設(shè)的綜合需求而被廣泛關(guān)注。目前，植物促生菌(plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)在生物防治中效果顯著，其在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增加作物產(chǎn)量的同時(shí)，還能防治松赤枯病、松赤落葉病、杉木炭疽病、杜仲環(huán)剝爛皮病、楊樹潰瘍病和楊樹爛皮病等森林病害[5,6]。洋蔥伯克霍爾德氏菌氏(Burkholderiacepacia,BBC)在防治腐霉病、立枯病等均有良好效果[7]。我國(guó)生防微生物資源豐富，而篩選出高效的生防菌株則是生物防治的基礎(chǔ)。本研究以林地土壤中篩選出的固氮菌株為研究對(duì)象，以林木常見病原菌尖孢鐮刀菌、腐皮鐮孢菌、膠孢炭疽菌、擬盤多毛孢菌為拮抗對(duì)象，期望篩選出在林地中定殖能力強(qiáng)、在防治林木病害的同時(shí)還能為林木的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)的多功能復(fù)合型廣譜拮抗菌株。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)菌株為103株固氮功能細(xì)菌，均由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林土壤室篩選，菌株均經(jīng)過了固氮基因nifH檢測(cè)及基礎(chǔ)的16S rDNA測(cè)序[8]。4種常見林木病原菌來自中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏中心。病原真菌分別為：尖孢鐮刀菌(菌種編號(hào)：cfcc 5672)、腐皮鐮胞菌(菌種編號(hào)：cfcc 88533)、膠孢炭疽菌(菌種編號(hào)：cfcc 6913)、擬盤多毛孢菌(菌種編號(hào)：cfcc 5143)。提取菌種后開始菌種活化，并進(jìn)行ITS序列的檢測(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1廣譜拮抗菌的篩選 初步篩選采用改良的PDA平板對(duì)峙法。將細(xì)菌菌液進(jìn)行涂板培養(yǎng)，待細(xì)菌長(zhǎng)出后，取直徑為1 cm的真菌菌株放置于細(xì)菌平板的中央，對(duì)照組則是在PDA空白平板中央放置1 cm的真菌菌株。將二者共同培養(yǎng)7 d后分別測(cè)量真菌菌株的菌落半徑。

抑制能力=[空白平板的真菌菌株半徑(cm)-細(xì)菌平板的真菌菌株半徑(cm)]/空白平板的真菌菌株半徑(cm)×100

1.2.2菌株的溶磷能力研究 篩選溶解無機(jī)磷的菌株時(shí)使用PKO培養(yǎng)基[9]，篩選有機(jī)磷的培養(yǎng)基為蒙金娜培養(yǎng)基[10]。在固體培養(yǎng)基平板上用十字法分為4個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域中心位置分布1個(gè)接種點(diǎn)，每個(gè)菌株1個(gè)平板4個(gè)接種點(diǎn)，培養(yǎng)4 d后，檢查菌落及溶磷圈的大小，計(jì)算出菌落溶磷透明圈直徑與菌落直徑的比值[11]。將形成溶磷圈的菌株接種在滅菌的搖瓶培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株接種3瓶，28℃ 150 r/min搖床培養(yǎng)7 d[12]。使用流動(dòng)分析儀(Futura愛利安斯法國(guó))測(cè)定有效磷含量。

1.2.3菌株的解鉀能力研究 以鉀正長(zhǎng)石粉為唯一鉀源，研究各菌株的解鉀能力。將平板上形成光滑透明油滴狀菌落的菌株接種在滅菌的搖瓶培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株接種3瓶，28℃ 150 r/min搖床培養(yǎng)7 d，使用原子吸收法(PEAA700 帕金-埃爾默 美國(guó))測(cè)定鉀含量。

1.2.4拮抗菌拮抗能力驗(yàn)證 綜合篩選后的廣譜拮抗菌株進(jìn)行液體驗(yàn)證。采用菌絲球干重法，讓細(xì)菌對(duì)各病原菌進(jìn)行動(dòng)態(tài)拮抗。將100 mL PDB培養(yǎng)基裝入250 mL錐形瓶中，滅菌?？瞻讓?duì)照是在培養(yǎng)基中接入1 mL病原真菌和1 mL無菌水；拮抗實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)基中接入1 mL細(xì)菌和1 mL病原真菌，120 r/min搖瓶培養(yǎng)5～7 d。將菌液進(jìn)行真空抽濾，將菌絲球60℃烘干至恒重。

抑菌能力=[空白對(duì)照中菌絲球干重(g)-拮抗實(shí)驗(yàn)中菌絲球干重(g)]/空白對(duì)照中菌絲球干重(g)×100

1.2.5菌株的菌種鑒定 首先對(duì)菌株進(jìn)行表觀觀察鑒定，隨后對(duì)菌株進(jìn)行分子鑒定，將其16S rDNA及功能基因gyrB序列與相關(guān)菌種進(jìn)行比對(duì)。其中2024菌株參考芽孢桿菌的功能基因gyrB-34F正向引物：5′-ggTgTWRgKgCNgTCgTAAACg-3′；gyrB-977R基因反向引物：5′-CCSgCAgARTCACCCTCTACg-3′。7014菌株參考泛菌的功能基因gyrB01-f正向引物：5′-TAARTTYgAYgAYAACTCYTAYAAAgT-3′，gyrB02-r基因反向引物：5′-CMCCYTCCACCARgTAMAgTT-3′。隨后使用GEN III OmniLog全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析及差異顯著性分析，使用MEGA 4.1軟件，Bootstrap的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用Sigma Plot(12.5)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣譜性拮抗菌的初篩

通過平板對(duì)峙研究得出，拮抗膠孢炭疽菌cfcc 6913菌株(拮抗能力≥80%)的細(xì)菌有62株；拮抗腐皮鐮孢菌cfcc 88533菌株(拮抗能力≥80%)的細(xì)菌有63株；拮抗擬盤多毛孢菌cfcc 5143菌株(拮抗能力≥80%)的細(xì)菌有54株；拮抗尖孢鐮刀菌cfcc 5672菌株(拮抗能力≥80%)的細(xì)菌有56株。綜合分析，對(duì)4種病原菌均有較強(qiáng)拮抗能力的菌株共有24株。

2.2 溶磷解鉀特性

將24株拮抗菌株的溶磷溶鉀能力進(jìn)行了定量實(shí)驗(yàn)(表1)。定量實(shí)驗(yàn)中溶解無機(jī)磷能力最強(qiáng)的菌株為3-i，溶磷量為36.43 mg/L；溶解有機(jī)磷能力最強(qiáng)的菌株為1020，溶磷量為4.25 mg/L；解鉀能力最強(qiáng)的菌株也為1020，解鉀量為6.79 mg/L。共同具有溶解無機(jī)磷、有機(jī)磷及解鉀能力的菌株有1020和2001兩株。

表1 溶磷解鉀能力研究Table 1 The research of soluble phosphorus and potassium releasing ability.

2.3 初篩菌株的初步鑒定

將含有其他功能的廣譜拮抗菌12株進(jìn)行初步的鑒定分類，提取各菌株的16S rDNA，并進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，9株菌株(1014、1005、1020、2004、2001、2007、3-i、3-s、7001)屬于Burkholderia屬，菌株1010和2024屬于Bacillus屬，7014菌株屬于Pantoea屬。并且從序列分析及形態(tài)學(xué)比對(duì)得出1010和2024可能為同一菌種的不同菌株；1020和2004可能為同一菌種的不同菌株；2001、2007、3-i及3-s可能為同一菌種的不同菌株。所以根據(jù)菌株的功能差異及生物信息學(xué)數(shù)據(jù)綜合分析，選取1005、1020、2001、2024、7001、7014菌株進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。

2.4 廣譜拮抗菌株的復(fù)篩

將預(yù)篩選到的6株細(xì)菌進(jìn)行液體復(fù)篩結(jié)果(圖1)表明，2024和7014菌株對(duì)4種病原菌均存在拮抗作用。6株細(xì)菌對(duì)膠孢炭疽菌均有拮抗作用，并且2001和2024菌株對(duì)膠孢炭疽菌的拮抗作用高達(dá)100%。但6株細(xì)菌對(duì)尖孢鐮刀菌的拮抗能力普遍較弱，拮抗尖孢鐮刀菌能力超過10%的只有7014菌株。1020和2001菌株對(duì)腐皮鐮胞菌沒有拮抗作用，而7014對(duì)腐皮鐮胞菌的拮抗能力最強(qiáng)，拮抗率可達(dá)97.82%。1005和7001對(duì)擬盤多毛孢菌沒有拮抗作用，但1020對(duì)擬盤多毛孢的拮抗作用高達(dá)100%。

2.5 篩選出的廣譜拮抗菌株菌種鑒定

對(duì)2024和7014菌株進(jìn)行菌種鑒定。圖2(彩圖見封三圖版)為兩菌株番紅染色的顯微照片，通過觀察可知2024菌株細(xì)胞成桿狀，7014菌株的細(xì)胞形態(tài)為短桿狀。2024及7014菌株與相關(guān)菌種的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析樹結(jié)果圖3，其中圖中發(fā)育樹節(jié)點(diǎn)只顯示Bootstrap值大于50%數(shù)值，上標(biāo)的“T”表示模式菌株。隨后，對(duì)兩菌株的gyrB功能基因進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)一步通過功能基因確定其系統(tǒng)發(fā)育位置。目的菌株與相關(guān)種的gyrB序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果見圖4。菌株2024和7014生理生化特征鑒定結(jié)果見表2和表3。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、生理生化數(shù)據(jù)、16S rDNA序列和gyrB功能基因序列數(shù)據(jù)多項(xiàng)鑒定分析，2024被鑒定為：枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillussubtilissubsp.subtilis)；7014被鑒定為成團(tuán)泛菌(Pantoeavagans)。

圖1 廣譜拮抗菌株的拮抗能力篩選Fig.1 Inhibitory ability screening of broad-spectrum bacterium.注：不同小寫字母表示不同菌株對(duì)同一病原真菌的抑菌能力差異顯著(P<0.05)。

圖2 菌株顯微照片F(xiàn)ig.2 Microscopic photographs of strains.(彩圖見封三圖版)

3 討論

通過逐步篩選，本研究最終篩選到最具有廣譜拮抗杉木病原菌潛力的功能菌株為2024和7014菌株。2024菌株可以溶解無機(jī)磷并具有解鉀能力、7014菌株具有溶解無機(jī)磷的能力。菌種鑒定結(jié)果表明2024菌株為枯草芽孢桿菌亞種，7014菌株為成團(tuán)泛菌。

通過綜合分析菌株的拮抗能力及菌株的復(fù)合功能，本研究最終篩選到的最具應(yīng)用潛力的廣譜拮抗菌株為2024和7014。通過形態(tài)學(xué)及生物學(xué)信息比對(duì)，判定2024菌株為枯草芽孢桿菌枯草亞種，7014菌株為成團(tuán)泛菌。前人的研究也得到與2024和7014菌株同屬的菌種存在拮抗能力，枯草芽孢桿菌被證實(shí)能夠拮抗柑桔潰瘍病[13]、葡萄灰霉病[14]、白菜炭疽病[15]。彭兵等[16]研究表明枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生一種抗真菌蛋白FV，可抑制真菌孢子的萌發(fā)，并影響菌絲的細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)。麻瑞陽等[17]的研究則表明枯草芽孢桿菌的菌株具有高效的解磷解鉀能力。前人關(guān)于泛菌屬的研究表明，泛菌屬能夠分解木質(zhì)素、纖維素，具有溶磷固氮特性，這與本研究中針對(duì)7014菌株的功能研究結(jié)果一致[18,19]。但關(guān)于泛菌屬拮抗功能的報(bào)道較少，其原因可能為：泛菌屬的菌株本身就是玉米褐腐病、?？菸　⑾憬度~鞘腐敗病等的病原菌[20～22]。在生防菌劑的推廣應(yīng)用中，從安全性考慮，會(huì)盡量避免使用菌種本身具有致病性的病原菌，所有針對(duì)7014菌株的研究需要進(jìn)行進(jìn)一步的安全性檢測(cè)。本研究篩選出較有應(yīng)用潛力的拮抗菌株，在后續(xù)的研究中，我們將繼續(xù)針對(duì)菌株的拮抗物質(zhì)穩(wěn)定性、拮抗機(jī)理及拮抗菌株在苗木上的應(yīng)用效果展開研究。

圖3 2024和7014菌株16S rDNA全序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree derived from 16S rDNA sequences of strain 2024 and 7014.

圖4 2024和7014菌株gyrB功能基因序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree derived from gyrB functional gene sequences of strain 2024 and 7014.

試驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果試驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果試驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果試驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果細(xì)胞形態(tài)桿狀革蘭氏染色陽性形成芽孢+接觸酶+氧化酶/VP反應(yīng)+甲基紅反應(yīng)-檸檬酸生長(zhǎng)+明膠水解+硝酸鹽還原+β-半乳糖苷酶+精氨酸雙水解酶+賴氨酸脫羧酶-鳥氨酸脫羧酶-H2S產(chǎn)生-脲酶-吲哚產(chǎn)生-陰性對(duì)照-a-D-葡萄糖+明膠+p-羥基苯乙酸-糊精+D-甘露糖+甘氨酸-L-脯氨酸-丙酮酸甲酯+D-麥芽糖+D-果糖+L-丙氨酸+D-乳酸甲酯-D-海藻糖+D-半乳糖-L-精氨酸-L-乳酸+D-纖維二糖+3-甲基-D-葡萄糖-L-天冬氨酸+檸檬酸+龍膽二糖+D-巖藻糖-L-谷氨酸+α-酮戊二酸-蔗糖+L-巖藻糖-L-組氨酸+D-蘋果酸-松二糖+L-鼠李糖-L-焦谷氨酸-L-蘋果酸+水蘇糖+肌苷+L-絲氨酸+溴代丁二酸+陽性對(duì)照+1%乳酸鈉+林可霉素-萘啶酸wpH6．0+夫西地酸-鹽酸胍w氯化鋰+pH5．0+D-絲氨酸-十四烷硫酸鈉-亞碲酸鉀+D-棉子糖+D-山梨醇+果膠+吐溫40-α-D-乳糖-D-甘露醇+D-半乳糖醛酸+γ-氨基丁酸-D-蜜二糖+D-阿糖醇-L-半乳糖酸內(nèi)酯+α-羥丁酸-β-甲基-D-葡糖苷+肌醇+D-葡糖酸+β-羥基-D，L-丁酸-D-水楊苷+甘油+D-葡萄糖醛酸-α-丁酮酸-N-乙酰-D-葡糖胺+D-葡糖-6-磷酸+葡糖醛酰胺-乙酰乙酸+N-乙酰-β-D-甘露糖胺-D-果糖-6-磷酸+粘酸+丙酸-N-乙酰-D-半乳糖胺-D-天冬氨酸-奎寧酸-乙酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸-D-絲氨酸-糖質(zhì)酸+甲酸+1%NaCl+醋竹桃霉素-萬古霉素-氨曲南+4%NaCl+利福霉素SV+四唑紫w丁酸鈉+8%NaCl+二甲胺四環(huán)素-四唑藍(lán)-溴酸鈉-

注：w表示無法判定。

表3 菌株7014的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Physiological and biochemistry test results of strain 7014.

注：w表示無法判定。

[1] 梁承豐. 中國(guó)南方主要林木病蟲害測(cè)報(bào)與防治[M]. 北京:中國(guó)林業(yè)出版社, 2003.

[2] 陳守常. 我國(guó)林木病害研究進(jìn)展與展望[J]. 中國(guó)森林病蟲, 1997(4):38-40.

[3] 宋玉雙, 黃北英. 中國(guó)林業(yè)有害生物防治技術(shù)的新進(jìn)展[J]. 中國(guó)森林病蟲, 2008, 27(6):31-34.

[4] 胡亞忱. 林木真菌的研究現(xiàn)狀[J]. 松遼學(xué)刊(自然科學(xué)版), 2002(4):60-61.

[5] 曾祥謂, 徐梅卿, 趙嘉平,等. 中國(guó)森林病害防治技術(shù)措施與策略[J]. 世界林業(yè)研究, 2005, 18(3):66-69.

[6] 邱德文. 我國(guó)植物病害生物防治的現(xiàn)狀及發(fā)展策略[J]. 植物保護(hù), 2010, 36(4):15-18.

[7] Szczech M, Shoda M. Biocontrol of Rhizoctonia damping-off of tomato byBacillussubtiliscombined withBurkholderiacepacia[J]. J. Phytopathol., 2004, 152(10):549-556.

[8] 劉彩霞, 焦如珍, 董玉紅,等. 模擬氮沉降對(duì)杉木林土壤氮循環(huán)相關(guān)微生物的影響[J]. 林業(yè)科學(xué), 2015, 51(4):96-102.

[9] 陳 俊, 陸俊錕, 康麗華,等. 紅樹林溶磷菌的初步鑒定、溶磷能力測(cè)定及其優(yōu)化培養(yǎng)[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2009, 36(8):1183-1188.

[10] 馬文文, 姚 拓, 蒲小鵬,等. 東祁連山7種禾草根際溶磷菌篩選及其溶磷特性[J]. 草業(yè)科學(xué), 2015, 32(4):515-523.

[11] 焦如珍, 彭玉紅. 海南島熱帶木本豆科植物根瘤菌的溶磷作用[J]. 林業(yè)科學(xué), 2010, 46(10):1-5.

[12] 焦如珍, 楊承棟, 孫啟武. 細(xì)菌肥料菌株對(duì)無效磷的轉(zhuǎn)化利用[J]. 林業(yè)科學(xué), 2005, 41(4):194-198.

[13] 劉 冰, 宋水林, 劉曉麗,等. 柑橘潰瘍病生防內(nèi)生細(xì)菌的篩選、鑒定及其活性代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 27(12):2152-2158.

[14] 王 偉, 牟圓圓, 黃 偉. 葡萄灰霉病生防拮抗菌的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 食品與機(jī)械, 2013, 29(6):191-196.

[15] 周小林, 黃振文, 劉人豪,等. 枯草芽胞桿菌HZB02的分離及其室內(nèi)抑菌效果[J]. 植物保護(hù), 2016, 42(1):138-143.

[16] 彭 兵, 張樹斌, 賈 宇,等. 枯草芽孢桿菌菌株A抗菌蛋白的分離純化及抗真菌機(jī)理[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 44(1):67-74.

[17] 麻瑞陽, 張愛民, 惠小雙,等. 高效解磷解鉀菌NX-11菌株的分離篩選、鑒定及最佳培養(yǎng)條件的確定[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2013, 28(2):202-208.

[18] Xiong X Q, Liao H D, Ma J S,etal.. Isolation of a rice endophytic bacterium,Pantoeasp. Sd-1, with ligninolytic activity and characterization of its rice straw degradation ability[J]. Lett. Appl. Microbiol., 2014, 58(2):123-129.

[19] 王志剛, 胡云龍, 徐偉慧,等. 一株溶磷菌的分離鑒定及對(duì)西瓜根系的促生效應(yīng)[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 27(5):798-803.

[20] 顧 沁, 張 昊, 黃 海,等. 一種玉米新型細(xì)菌性褐腐病的病原鑒定[J]. 植物保護(hù), 2016, 42(3):87-90.

[21] Carr E A, Zaid A M, Bonasera J M,etal.. Infection of onion leaves byPantoeaananatisleads to bulb infection[J]. Plant Dis., 2013, 97(12):1524-1528.

[22] 嚴(yán)玉寧, 何 紅, 葉藝俊,等. 香蕉葉鞘腐敗病病原鑒定[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2011, 41(2):124-130.