張 斌, 劉曉志, 周敬華, 魏敬雙, 高 健, 王志明*

1.華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司, 抗體藥物研制國家重點實驗室, 石家莊 050015; 2.河北省計劃生育科學研究院男科實驗室, 石家莊 050000

蛋白質(zhì)糖化反應(yīng)是發(fā)生在蛋白質(zhì)氨基基團上的一種非酶催化過程，主要發(fā)生在賴氨酸側(cè)鏈的α-氨基胺和ε-氨基胺末端，同還原型糖如葡萄糖、果糖和半乳糖等發(fā)生反應(yīng)。1912年，Maillard第一次對這種發(fā)生在氨基酸和還原糖之間的反應(yīng)進行了描述。還原型糖的醛基可逆的聚集在胺基周圍，兩個基團間形成一種不穩(wěn)定的希夫堿中間體，并自發(fā)多級Amadori重排反應(yīng)，形成更穩(wěn)定的氨基酮共價鍵。在一定條件下，氨基酮產(chǎn)物可以將結(jié)合的糖殘基解離。例如，高度糖化的抗體藥物在37℃、pH 7、沒有葡萄糖的磷酸鹽緩沖液中孵育100 h，總糖基化水平從42%下降到20%，這說明糖化反應(yīng)是一個可逆反應(yīng)。

正電荷的伯胺多分布在蛋白質(zhì)分子表面，但這些位點中只有一部分可以和還原糖分子發(fā)生特異反應(yīng)。研究顯示，沒有特定氨基酸序列與糖化反應(yīng)相關(guān)。但是，蛋白質(zhì)局部的三維結(jié)構(gòu)可以影響糖化反應(yīng)形成。某些蛋白質(zhì)(例如肝醇脫氫酶、RNase A、 DNaseⅠ、白蛋白、血紅蛋白)的組氨酸殘基或堿性氨基酸殘基(精氨酸和賴氨酸)可能和糖化反應(yīng)相關(guān)。重組人源化單克隆抗體同抗原結(jié)合片段的建模實驗表明，在49位賴氨酸殘基處通常發(fā)生高水平的糖化反應(yīng)，49位賴氨酸殘基接近互補決定區(qū)2(CDR2)被輕鏈CDR1的一個天冬氨酸殘基進行了催化。同樣位于其他重組人源化單克隆抗體重鏈99位的賴氨酸殘基優(yōu)先發(fā)生糖化，因為受到了鄰近羧酸的催化。

在高溫氧化條件下(包括體內(nèi)循環(huán))，含有Amadori的糖化蛋白可能被緩慢降解形成晚期糖化終產(chǎn)物(AGEs)。晚期糖化終產(chǎn)物包括羧甲基賴氨酸(CML)、戊糖、吡咯啉和咪唑啉酮。AGEs與某些病理反應(yīng)有關(guān)，如糖尿病、關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化相關(guān)淀粉樣變性以及衰老等。生理性的AGEs形成與氧化和炎癥過程相關(guān)，而與葡萄糖水平無關(guān)，這個過程可能持續(xù)幾個月或幾年。在體內(nèi)，晚期糖基化修飾的蛋白可誘發(fā)AGEs特異性受體的表達，觸發(fā)抗AGEs蛋白的免疫反應(yīng)，改變細胞信號轉(zhuǎn)導及細胞功能。AGEs損壞蛋白具有高生物活性，如交聯(lián)、結(jié)構(gòu)改變以及高度的聚集，這些非正常的結(jié)構(gòu)蛋白可以對許多細胞(如內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞、視網(wǎng)膜和白細胞)產(chǎn)生毒副作用，并且和很多嚴重疾病相關(guān)[1]。許多研究表明糖化血紅蛋白水平升高與心血管疾病及動脈粥樣硬化有著密切關(guān)系[2]。人體的血漿蛋白，如白蛋白、球蛋白、纖維蛋白和膠原蛋白也可能被糖化，進而形成AGEs，AGEs參與了糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病過程，糖尿病并發(fā)癥包括視網(wǎng)膜病變、白內(nèi)障、神經(jīng)病變、腎病和心肌病等[3]。有研究認為，高血糖可能在這些疾病的發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，通過誘導蛋白質(zhì)糖化，從而使蛋白質(zhì)功能喪失、聚集或沉積。在帕金森病患者的大腦中檢測到糖化的Lewy小體。在阿爾茨海默病患者中，β淀粉樣肽的糖化加劇了其毒性，加速了神經(jīng)退行性病變。另外，研究發(fā)現(xiàn)糖尿病是多種神經(jīng)退行性疾病的危險因素，包括帕金森病和阿爾茨海默病。因此，蛋白質(zhì)糖化成為神經(jīng)保護治療干預(yù)帕金森和阿爾茨海默氏病的一個新的戰(zhàn)略發(fā)展方向[4]。在治療性重組抗體藥物生產(chǎn)中，無論蛋白質(zhì)的糖化水平高低，都沒有觀察到AGEs的形成。

對于治療性抗體藥物，蛋白質(zhì)糖化可能對藥物產(chǎn)生潛在影響，如阻滯生物學功能或誘導聚集，因此，蛋白質(zhì)糖化是潛在的關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA)。因此需要進行深入研究，以揭示抗體藥物糖化結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。本文綜述了抗體糖化相關(guān)的修飾反應(yīng)、抗體糖化檢測方法以及對于生物功能的潛在影響，以期為藥物的開發(fā)、優(yōu)化及貯存條件研究提供參考。

1 治療性抗體的糖化原因

由于治療抗體生產(chǎn)過程復雜，抗體藥物糖化反應(yīng)并不多見，其反應(yīng)動力學以及糖化水平不易預(yù)測?？贵w藥物糖化反應(yīng)多發(fā)生在發(fā)酵過程中，發(fā)酵液中的葡萄糖是工程細胞的重要能量來源。糖化水平和細胞培養(yǎng)過程中總糖的含量相關(guān)。為了維持培養(yǎng)基生理條件，培養(yǎng)時需要對培養(yǎng)的溫度、pH、時間、離子強度等進行調(diào)控，這可能對動力學以及糖化程度產(chǎn)生影響。其中，己糖可以和氨基發(fā)生特異反應(yīng)影響蛋白質(zhì)糖化，進而增加了抗體藥物的異質(zhì)性[5]。

藥物儲存過程中，制劑中的還原糖可能通過糖化反應(yīng)加入到抗體藥物中。甚至在冷凍干燥后的固體狀態(tài)藥物，制劑中的還原糖也可以和抗體藥物發(fā)生糖化反應(yīng)。制劑中酸度和溫度升高會加速蔗糖水解，產(chǎn)生還原性糖，進而導致糖化反應(yīng)發(fā)生。糖化反應(yīng)的速度也取決于制劑中緩沖鹽成分和糖的類型。然而，在優(yōu)化的存儲條件下，藥物整體糖化水平很小甚至沒有。而有研究顯示，制劑溶液的儲存溫度和儲存時間可能影響藥物的糖化水平，如4～5℃，1～21個月的制劑溶液穩(wěn)定性數(shù)據(jù)顯示，藥物糖化水平很低；相同制劑儲存溫度從29℃調(diào)整到37℃，1～21個月的數(shù)據(jù)顯示糖化水平顯著升高[6]。

抗體藥物上有一些潛在的糖化反應(yīng)位點，但其整體糖化水平通常很低，這給抗體藥物的糖化分析和鑒定帶來了諸多挑戰(zhàn)。為了研究糖化抗體的特性，有研究者利用在抗體易感位點進行強制糖化反應(yīng)。在強制糖化反應(yīng)中，抗體藥物會和高濃度的還原糖(如葡萄糖或蔗糖)一起高溫孵育，高溫和低pH會誘使糖化反應(yīng)加速[7]。

抗體藥物在體內(nèi)循環(huán)的過程中也會發(fā)生糖化反應(yīng)。人體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中內(nèi)源性IgG的含量大約為10 mg/mL，健康人內(nèi)源性IgG測定糖基化水平之間的差別很大，每個IgG含有0.14～5個葡萄糖，對應(yīng)的整體糖化水平為14%～500%。治療性抗體藥物循環(huán)系統(tǒng)通常的含量為0.2 mg/mL，對應(yīng)的整體糖化水平為10%～25%。賴氨酸殘基的平均糖化水平接近治療性抗體，內(nèi)源性IgG或是人血白蛋白在循環(huán)系統(tǒng)中的濃度。在內(nèi)源性條件下，若IgG不包含高活性糖化位點，那么糖化反應(yīng)將擴散到整個分子，在所有潛在糖基化位點進行低水平的糖化反應(yīng)[8]。

2 抗體糖化的分析方法

2.1 硼酸親和色譜

硼酸親和色譜(boronate affinity chromatography, BAC)是一種分離和富集順式二醇化合物的技術(shù)。堿性pH條件下，固定相中硼酸官能團會形成一個陰離子四面體，這個四面體可以和糖分子的順式陣列結(jié)構(gòu)相互作用，進而分離含糖化合物。然后，可以使用降低pH或增加競爭羥基(如山梨醇)的方法洗脫含糖化合物。由于該方法需要檢測樣品少，并可常溫檢測，因此BAC常用于抗體糖化的定性和定量檢測分析。使用BAC檢測治療性抗體藥物時，先洗脫下來的是非糖化峰，最后洗脫出的是糖化峰。為了防止抗體藥物同分析柱固相填料之間的非特異性結(jié)合，一般在流動相中加入隔離試劑，如Tris等。對隔離試劑濃度、pH和緩沖鹽組分進行優(yōu)化，確定原料藥中可以允許的糖化水平。利用BAC結(jié)合其他方法可以對收集分離組分的糖化成分進行進一步的研究[9,10]。雖然，BAC被廣泛的應(yīng)用于糖化成分的富集，但它有一定的局限性，因為某些糖基化成分會產(chǎn)生非特異性結(jié)合[11]。BAC的定量檢測也是估算，因為它不能對蛋白質(zhì)的單糖化和多糖化進行區(qū)分。

2.2 基于電荷的方法

由于糖化位點正電荷的缺失，可以使用毛細管等電聚焦(capillary isoelectric focusing, cIEF) 或毛細管等電聚焦成像(imaged capillary electric focusing, icIEF)技術(shù)進行檢測。將酸性區(qū)域充分糖化，將保留硼酸組分同非糖化、非保留酸組分進行比較。毛細管等電聚焦成像檢測糖化抗體的分辨率為0.05 pI單位，而理論上一個封閉的賴氨酸殘基的差異是0.09 pI單位。這些電荷差分離方法也可以在混合糖化中觀察到非糖化硼酸組分。

離子交換色譜法(IEC)也可以檢測糖化和非糖化蛋白表面的電荷差異。線性梯度洗脫時，糖化硼酸組分表現(xiàn)為相對主峰的一個特異性遷移。IEC洗脫的酸性變體在一定程度上被富集。Quan等[12]觀察到，與最初的普通抗體相比，完全糖化的硼酸抗體已遷移到酸性區(qū)域。這個遷移量相當于線性梯度中0.5 mmol/L的氯化鈉。對于糖化硼保留片段的IEC峰也明顯變寬，而對于非片段起始物，非糖化硼保留片段(非糖化)IEC峰變窄。

總體而言，對于從起始物種分離糖化成分，IEC方法似乎沒有足夠的分辨率，因為整個分子低水平糖化多個位點具有結(jié)合電荷效應(yīng)。相比之下，由于同樹脂獨特的相互作用，羧基末端上不結(jié)合，以及結(jié)合1個或是2個分子賴氨酸殘基，使用IEC方法可以將他們依次分離鑒定。

2.3 液相色譜-質(zhì)譜法

自頂向下質(zhì)譜常用于分析完整的或酶切抗體分析，也可以用于糖化水平分析。另外，基質(zhì)輔助激光解吸離子化技術(shù)(matrix-assisted laser desorption/ionization,MALDI)和電離噴霧(electrospray ionization,ESI)技術(shù)也可以用于糖化水平分析。由于每個糖化位點會增加162 Da的質(zhì)量位移，自頂向下質(zhì)譜常用于抗體糖化水平的快速評估。去糖化和C-末端賴氨酸后，用質(zhì)譜法測定糖化水平，方法的檢測限為1%，定量限為3%，這結(jié)果同BAC方法基本一致[13]。

自頂向下質(zhì)譜肽圖方法被用于糖基化位點的確定。由于賴氨酸殘基的糖化可以抑制胰蛋白酶的活性，胰蛋白酶活性被抑制并且增加162 Da的分子量，意味著這是一個糖化的賴氨酸位點。BAC截留片段或強制糖化樣品的胰蛋白酶肽譜，結(jié)果可以顯示整個抗體的易糖化位點[14]。

傳統(tǒng)質(zhì)譜方法存在的問題是敏感性低，特別是當用于檢測低豐度的糖化抗體藥物時。在檢測多肽時，問題更加突出，因為糖化反應(yīng)通常發(fā)生在多個賴氨酸殘基上。使用傳統(tǒng)質(zhì)譜-自頂向下質(zhì)譜肽圖方法的另一個問題是，串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)實驗時，糖分子的碰撞誘導解離反應(yīng)致使中性水分子不同程度丟失，這對于低水平糖化位點的檢測帶來了更大的挑戰(zhàn)。另一種質(zhì)譜裂解方式是電子轉(zhuǎn)移解離(ETD)。裂解方法比較的研究顯示，ETD方法提供完整的序列片段，沒有中性水分子丟失。這些需要更多的糖化分析實驗進行確認和驗證。另外，減少硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉的使用，再使用胰蛋白酶進行酶切，串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)技術(shù)進行肽圖分析，這樣可以更好的提高檢測的靈敏度并減少糖肽的中性丟失。在這種方法中，由于糖化糖減少，碳水化合物和肽之間的化合鍵穩(wěn)定，可以達到串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)高質(zhì)量數(shù)據(jù)。

液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS/MS)串聯(lián)是研究AGEs的常用方法。通過肽圖對潛在糖化位點進行評價，進而檢測AGEs水平[15,16]。一些主要的AGEs(如CML 和CEL)可以通過，修飾肽和所有電荷狀態(tài)的野生型肽的肽圖面積比進行定量。由于AGEs的種類很多，每一種AGEs都需要進行單獨定量。除賴氨酸外，精氨酸殘基也是抗體藥物發(fā)生修飾的潛在位點[17]。對α-晶狀體球蛋白進行水解，并利用LC-MS對蛋白糖化分布進行分析，結(jié)果顯示體外與體內(nèi)的糖化蛋白中賴氨酸殘基的糖化修飾不同[18]。

同位素標記也被應(yīng)用于抗體糖基化分析。有研究者使用抗體藥物同12C/13C6還原糖進行1∶1混合，37 ℃孵育進行強制糖化反應(yīng)。胰蛋白酶對糖化的樣品和對照品進行消化，利用LC-MS/MS對樣品進行糖化分析。通過給予具有強度相當(相差6.018 Da)的兩分子離子一個特異標記，將LC/MS分析胰蛋白酶消化糖肽洗脫產(chǎn)物的方法進行了簡化。對強化糖化樣品中所有糖化位點進行分析，天然樣品中檢測糖化肽的分析是簡化的。這種方法能夠識別特異性糖化位點，不僅檢測速度快，還提高了檢測靈敏度，糖化水平在0.5%以下也能夠被檢測[19]。

另一種同位素標記方法包括硼氫化鈉還原步驟。在該方法中，樣品被分為A和B兩等份，分別使用硼氫化鈉和硼氘化鈉進行還原，再進行胰蛋白酶消化，這導致在糖化肽上分別有2 Da或3 Da分子量的增加。利用LC-MS/MS對1∶1混合的A和B的樣品進行分析， 1 Da的分子量差異被用于確認糖化的多肽并計算糖化的相對含量。這些結(jié)果表明，當同位素穩(wěn)定分布并考慮峰重疊時，1 Da的分子量差異足以進行相對定量分析。

2.4 比色法

抗體糖化形成的氨基酮可以用硝基四氮唑藍(NBT)還原法進行定量檢測。1983年，Johnson等[20]首次對檢測蛋白糖化的NBT還原法進行了介紹，糖化蛋白的氨基酮組分被NBT還原，從而導致525 nm處吸光值改變。該方法已用于多賴氨酸和糖化白蛋白的檢測。2012年，Ahmad等[21]把該方法應(yīng)用于糖化抗體的檢測。最近，Butko等[22]報道了在重組抗體生產(chǎn)中產(chǎn)生的一些AGEs，同抗體溶液的顏色變化密切相關(guān)。另外，利用靶向特異AGEs的生物素標記抗體，設(shè)計的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法也可用于AGEs檢測。

3 對抗體藥物生物學功能的影響

研究糖化修飾對單克隆抗體功能影響的報道結(jié)果差異巨大，這可能與糖化的數(shù)量和位置有關(guān)。在一些糖化位點上，強制條件下(總糖化95.4%)或抗體生產(chǎn)細胞生理條件下(糖化10%～40%)發(fā)生糖化反應(yīng)。有研究證實，高糖化水平與高糖溶液下的細胞應(yīng)激反應(yīng)、高溫儲存以及存放時間等條件有關(guān)。在正常的細胞培養(yǎng)條件(如溫度和pH)下，提高葡萄糖濃度，生產(chǎn)得到的抗體的糖化位點與內(nèi)源性抗體相似。雖然單克隆抗體糖化通常不會對抗體結(jié)合活性產(chǎn)生較大影響，但也可能造成一些抗體活性的喪失。抗體AGEs對活性的影響尚未見報道，但是AGEs可能降低了干擾素a-1的治療效果。強制糖化抗體的FcRn結(jié)合活性研究及小鼠體內(nèi)模型實驗結(jié)果顯示，一定程度的糖化水平對抗體動力學不產(chǎn)生影響[23]。另外，糖化的核糖核酸酶A無法同核糖核酸酶抑制劑(RI)和DNA結(jié)合。同時也發(fā)現(xiàn)，這種糖化蛋白不能參與DNA的解鏈過程[24]。

在免疫原性和安全性方面，典型治療性單克隆抗體和內(nèi)源性抗體的恒定區(qū)域通常非常相似，所以單克隆抗體的恒定區(qū)域的糖化被認為同內(nèi)源性單克隆抗體類似，因此關(guān)注較少。據(jù)推測，在抗體恒定區(qū)域的賴氨酸殘基已經(jīng)進化為抗糖化形式。關(guān)于治療性抗體糖化的一個擔憂是免疫原性問題，尤其是AGEs，AGEs具有較正?？贵w更高的免疫原性[21]。

由于炎癥、類風濕關(guān)節(jié)炎患者中發(fā)現(xiàn)了AGEs的存在。AGEs破壞性抗體能夠觸發(fā)RA患者免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗IgG自身抗體。AGEs破壞性抗體是一個有效免疫原，可以觸發(fā)類風濕關(guān)節(jié)炎患者抗原驅(qū)動的自身抗體產(chǎn)生[2,25]。然而，通過細胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化，在抗體藥物中AGEs含量非常低或沒有[22]。

抗體聚體對于免疫原性和安全性是一個關(guān)鍵質(zhì)量屬性。關(guān)于糖化水平和聚集相關(guān)性，各報道結(jié)論不一，有研究顯示二者相關(guān)，另有研究將糖化抗體同對照抗體40℃存放1周，沒有發(fā)現(xiàn)聚體水平差異。對于AGEs，有研究顯示AGEs和治療性抗體降解和交聯(lián)有關(guān)[26]。

4 展望

糖化是一種常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾反應(yīng)，常發(fā)生在治療蛋白(如，抗體)的生產(chǎn)和儲存過程中。BAC和LC-MS是目前分析抗體整體糖化水平的標準方法。由于個別位點的糖化水平很低，因此使用強制糖化方式識別糖化位點。糖化修飾位置影響蛋白的生物活性，并且是抗體特異性的。研究顯示，抗體糖化對Fc結(jié)合或PK沒有造成顯著影響[27,28]。為了降低糖化和AGEs形成風險，確保治療藥物的安全性和有效性，應(yīng)該開發(fā)和優(yōu)化相應(yīng)的細胞培養(yǎng)、制劑和貯存條件。

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