魯 念, 劉興健, 胡小元, 李軼女, 易詠竹, 張志芳*

1.中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所, 北京 100081; 2.中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所, 江蘇 鎮(zhèn)江 212018

腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)是無包膜的單鏈DNA(single-strand DNA，ssDNA)病毒，直徑為18～25 nm。到目前為止，研究人員發(fā)現(xiàn)其至少有120種新血清型，其中，已經(jīng)從人類和靈長類中分離鑒定到的血清型有12種[1]。

AAV主要由反向末端重復序列(inverted terminal repeat sequences，ITRs)、復制基因(rep)和衣殼基因(cap)3個結構基因構成。ITRs折疊形成發(fā)卡結構，是AAV復制、包裝、整合所需的唯一的順式作用元件，在病毒粒子轉染細胞時可能起到穩(wěn)定病毒基因組的作用；rep編碼的蛋白質(zhì)可將AAV基因組從宿主染色體上切割下來，并調(diào)節(jié)基因組的復制、整合和包裝；而cap編碼的3個衣殼蛋白(VP1、VP2和VP3)[2]可自組裝成無包膜的二十面體病毒衣殼。

AAV最早于19世紀60年代從腺病毒中被分離出來，并通過血清學等分析方法將其歸納到細小病毒科(Prvovirdae)依賴病毒屬(Dependovirus)。1984年，作為病毒載體， AAV首次被用于哺乳動物細胞中表達外源基因[3]。因為AAV具有安全性高(至今未發(fā)現(xiàn)其對人具有致病作用)、特異性強(有數(shù)十種血清型，不同血清型對不同器官具有特異識別感染能力)、擴散性強(具有遠高于腺病毒和慢病毒的擴散性)、免疫原性低(感染不同組織時幾乎不會被免疫系統(tǒng)清除)、感染譜廣(可感染分裂期和靜止期的細胞)等優(yōu)點[4]，使其逐漸成為基因治療中最常用的病毒載體。

AAV包裝一般是在人源或哺乳動物來源的細胞以及昆蟲細胞中實現(xiàn)的[5]。如在人胚胎腎細胞(HEK293T)中，先將含有rep、cap基因的質(zhì)粒pHelper和含有目的基因的質(zhì)粒pAAV轉染進入細胞，再通過輔助病毒誘導得到目的rAAV。該方法獲得rAAV的生產(chǎn)效率最高只能達到104vg/cell[6]。為了得到足夠用于臨床試驗的rAAV，至少需要培養(yǎng)5 000瓶175 cm2細胞瓶的細胞[7]，且操作較為復雜，在實際應用中難以實現(xiàn)。另一種方法則是利用桿狀病毒-細胞(如AcMNPV-sf細胞)表達系統(tǒng)在昆蟲細胞中包裝rAAV[8]，將包裝rAAV所需的基因分別克隆到桿狀病毒上，并用這些桿狀病毒共同感染草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)卵巢細胞系Sf9，從而在懸浮培養(yǎng)的昆蟲細胞中獲得rAAV，用10 L攪拌罐反應器發(fā)酵約3 d，其產(chǎn)量達到1.1×1014vg/L[9]，該方法較用人源細胞包裝的方法便利，但在實際應用中，該方法包裝的rAAV單次治愈劑量的標價高達160萬美元，由于造價較高，無法實現(xiàn)廣泛應用。

BmNPV表達系統(tǒng)也是一種較為常用的桿狀病毒表達系統(tǒng)，在重組蛋白表達應用中，5個蠶蛹外源蛋白的表達量就相當于1 L昆蟲細胞的表達量[10]，而其生產(chǎn)成本比昆蟲細胞低幾百倍。因此，BmNPV表達系統(tǒng)可以作為生產(chǎn)rAAV的一種經(jīng)濟高效的選擇。在家蠶幼蟲的血淋巴中各類基因的表達量分別是在sf細胞中表達量的幾十倍甚至上百倍。而BmNPV-家蠶表達系統(tǒng)與AcMNPV-sf細胞表達系統(tǒng)相比表達量較高的主要原因是：AcMNPV在sf細胞培養(yǎng)基中的病毒基因組數(shù)目通常為108～109vg/mL，即使在高密度發(fā)酵的昆蟲細胞中也很難超過1010vg/mL，其rAAV的理論包裝量也不應該超過這一數(shù)值；而BmNPV在每毫升家蠶血淋巴和每克蠶蛹中的病毒基因組數(shù)目均能達到1012～1013vg[11]，因此用BmNPV-家蠶表達系統(tǒng)包裝rAAV的最高理論包裝量至少是等體積AcMNPV-sf細胞表達系統(tǒng)的上百倍。此外，家蠶的飼養(yǎng)成本遠遠低于昆蟲細胞的培養(yǎng)成本。綜上所述，BmNPV-家蠶表達系統(tǒng)是一個比較理想的生產(chǎn)rAAV的系統(tǒng)。

本研究利用家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)來包裝含有報告基因的2型 AAV(AAV2)。AAV2是最早用作病毒載體的血清型[3]，也是目前為止最適合用做基因治療載體的血清型[12]，大多數(shù)基因治療研究也都是以2型為模型。為了簡便研究，本次實驗使用的是假型包裝載體(pseudotype virus)[13]，即這種載體的所有重組基因組都用AAV2型的ITRs和rep基因，只有cap是根據(jù)需要選擇血清型。因此，不同血清型的物理性質(zhì)已經(jīng)足夠親近，使得它們能夠用接近2型的條件來生產(chǎn)純化。

目前并沒有使用家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)包裝rAAV的研究，本次實驗首次使用家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)包裝rAAV，為今后使用單桿狀病毒包裝rAAV提供了理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1試驗試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司，F(xiàn)ast pfu購自北京全式金生物技術有限公司，TC100培養(yǎng)基購自Applichem公司，DMEM(高糖)培養(yǎng)基、FBS購自Gibco公司，脂質(zhì)體購自Invitrogen公司。

1.1.2供試載體、質(zhì)粒、細胞和病毒 桿狀病毒轉移載體pVL1393購自Invitrogen公司，病毒復制基因失活拯救型家蠶桿狀病毒reBmBac、表達綠色熒光蛋白的重組水泡性口炎病毒(VSV-GFP)均由本實驗室保存，大腸桿菌DH10Bac、Top10、家蠶細胞BmN細胞系、人胚胎腎細胞HEK293T細胞系等為本實驗室保存。

BmN細胞系的培養(yǎng)和準備：根據(jù)Summers和Smith的操作手冊[14]，用含有FBS的TC100昆蟲培養(yǎng)基培養(yǎng)家蠶BmN細胞系，達到合適的密度(106個/mL)后,接種到六孔板中或者35 mm的細胞培養(yǎng)皿上培養(yǎng)8～12 h，用于共轉染構建重組病毒。

HEK293T細胞系的培養(yǎng)和準備：用DEME培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293T細胞系，達到合適的密度(106個/mL)后,接種到六孔板中或35 mm的細胞培養(yǎng)皿上培養(yǎng)8～12 h，用于檢測包裝后的rAAV2病毒活力。

1.1.3AAV2的獲得 根據(jù)文獻報道[15]，獲得了AAV2病毒的rep2序列(GenBank: AF043303 )、cap2序列(GenBank：AAA42372)。Chen[16]研究發(fā)現(xiàn)，將cap2啟動子改為polh，研究表明在cap序列中插入一個intron(將家蠶polh啟動子序列插入intron序列的第26位堿基)能有效提高蛋白的表達，本研究在rep2序列的第850位堿基、cap2 VP1的第25位堿基后分別插入intron(含家蠶polh)。同時，在啟動子序列前插入BglⅡ酶切位點，在cap2序列后插入XbaⅠ，以方便后續(xù)進行血清型的替換。在設計完成的rep2序列5′端加上BglⅡ酶切位點和Kozak序列，3′端加上終止密碼子、單純皰疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase，HSV tk)polyA和XbaⅠ酶切位點；在設計完成的cap2序列5′端加上BamHⅠ酶切位點和Kozak序列，3′端加上終止密碼子、牛生長素(bovine growth hormone，BGH)polyA和EcoRⅠ酶切位點。設計完成后交由南京金斯瑞公司進行合成并克隆到pUC-simple載體上，得到pUC-Cap2和pUC-Rep2。

根據(jù)文獻報道[15]，獲得了AAV2兩端ITRs序列，在ITRs序列中間插入CMV啟動子和多克隆位點(multiple cloning site，MCS)。尾端插入猴病毒40(simian virus 40，SV40)polyA，在設計完成的ITRs序列5′端加上EcoR V酶切位點，3′端加上BglⅡ酶切位點。設計完成后交由南京金斯瑞公司進行合成并克隆到pUC-simple載體上，得到pUC-ITRs-MCS。

1.2 含AAV2基因轉移載體的構建

將載體pUC-ITRs-MCS用EcoR V-BglⅡ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段ITRs-MCS，與經(jīng)同樣雙酶切處理的轉移載體pVL1393用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞，在含有Amp抗生素的LB平板上培養(yǎng)。獲得陽性克隆后提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，篩選出連接有相應大小目的片段的克隆，測序鑒定正確后得到轉移載體pVL1393-ITRs-MCS。

將載體pUC-Cap2用BglⅡ-EcoRⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段cap2，與經(jīng)同樣雙酶切的轉移載體pVL1393用T4連接酶連接，重復上述步驟，測序鑒定正確后獲得轉移載體pVL-Cap2。

將載體pUC-Rep2用BglⅡ-XbaⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段rep2，與經(jīng)同樣雙酶切的轉移載體pVL1393用T4 DNA連接酶連接，重復上述步驟，測序鑒定正確后得到轉移載體pVL-Rep2。

EGFP、Luc是兩個較為常用的報告基因，由于其表達檢測方便、靈敏度高[17]，本實驗選取這2個基因作為標記基因。EGFP來源于載體pEGFP-N3，Luc來源于載體pGL3-basic。PCR擴增[18]獲得基因后分別用BamHⅠ-XbaⅠ和BamHⅠ-EcoRⅠ進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段EGFP和Luc，與經(jīng)同樣雙酶切處理的轉移載體pVL1393-ITRs-MCS用T4連接酶連接，重復上述步驟，測序鑒定正確后得到轉移載體pVL-EGFP和pVL-Luc。

1.3 重組桿狀病毒的構建

根據(jù)失活拯救型reBmBac構建重組病毒的方法[19]，將適量的轉移載體pVL-Luc、pVL-EGFP、pVL-Cap2、pVL-Rep2分別和純化的reBmBac病毒DNA共轉染BmN細胞系，27℃培養(yǎng)4～5 d,待細胞感染發(fā)病并剝落后收集共轉染上清液，獲得重組病毒reBm-Luc、reBm-EGFP、reBm-Cap2、reBm-Rep2。

1.4 利用桿狀病毒在家蠶中包裝獲得rAAV2

將上述獲得的重組家蠶桿狀病毒進行純化并在細胞中進行擴增、病毒鑒定和病毒滴度測定后，將AAV骨架序列的重組病毒(reBm-Rep2、reBm-Cap2)與報告基因的重組病毒reBm-Luc、reBm-EGFP分別按等比例混合后注射感染5齡起家蠶幼蟲(105pfu/頭)，在濕度65%、溫度25℃～27℃的條件下培養(yǎng)108～120 h，觀察家蠶發(fā)病情況并收集含有rAAV2表達產(chǎn)物的蠶血淋巴，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 重組桿狀病毒的PCR鑒定

將重組病毒注射感染正常5齡期基因家蠶幼蟲，獲得重組桿狀病毒表達的蛋白及復制的病毒粒子。提取病蠶血淋巴基因組，以其為模板，設計特定引物(表1)，通過PCR鑒定目的片段是否重組到病毒基因組中。PCR擴增體系(50 μL)：病毒基因組 1 μL，5×Buffer 10 μL，上下游引物各1 μL，dNTP 1 μL，F(xiàn)ast pfu 1 μL，ddH2O 35 μL。PCR程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共30個循環(huán)；72℃ 5 min。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequences of PCR primers.

1.6 家蠶中包裝的rAAV2的純化

將上述實驗收集的蠶血淋巴在-80℃和37℃間反復凍融4次，用來破碎細胞；10 000 r/min離心10 min，收集上清即得到rAAV2-EGFP、rAAV2-Luc病毒，60℃加熱30 min以滅活桿狀病毒，于-80℃保存待進一步純化。

將收集的含重組腺相關病毒載體的病毒液，重懸于PBS溶液中，加入1/10體積的氯仿，置于37℃搖床中劇烈振蕩1 h，利用AAV耐氯仿的特性來去除雜蛋白；加入固體氯化鈉至終濃度1 mol/L，振蕩溶解，4℃、12 000 r/min離心15 min， 取出上層水相，棄氯仿和沉淀；加PEG8000至終濃度達到10%(w/V)，振蕩溶解后冰浴靜置1 h，用來沉淀rAAV病毒顆粒，隨后，11 000 r/min離心15 min，棄上清，用5 mL PBS緩沖液將各離心管管底和管壁上的沉淀吹打洗脫下來合并，再將其分裝至1.5 mL 離心管中，加入DNA酶和RNA酶至終濃度為1～2 μg/mL，室溫下消化30 min。加等體積的氯仿抽提，4℃、11 000 r/min離心5 min，進一步去除雜蛋白；將純化的病毒液裝入Milipore濃縮柱(3 kDa)中，6 000～7 000 r/min離心，濃縮為500 μL，即為純化的rAAV2-EGFP和rAAV2-Luc病毒。

1.7 家蠶中包裝的rAAV2的生物活性檢測

將HEK293T細胞接種到六孔板中(1×105個/孔)，取100 μL的rAAV2-EGFP、rAAV2-Luc病毒分別置于接種好的細胞中進行孵育，24～48 h內(nèi)觀察綠色熒光蛋白、熒光素酶的表達情況。

2 結果與分析

2.1 含AAV2基因轉移載體的構建

由轉移載體pVL-Cap2、pVL-Rep2、pVL-Luc和pVL-EGFP的酶切鑒定結果(圖1)可知，pVL-Rep2(BamHⅠ-XbaⅠ)雙酶切后約2 500 bp，pVL-Cap2(EcoR V-EcoRⅠ)雙酶切后約2 900 bp， pVL-Luc(BamHⅠ-EcoRⅠ)雙酶切后約1 700 bp，pVL-EGFP(BamHⅠ-XbaⅠ)雙酶切后約730 bp。電泳條帶大小與目的片段大小一致，說明目的片段成功插入轉移載體中，后續(xù)測序也與酶切鑒定結果一致。

圖1 含AAV2基因轉移載體的酶切鑒定Fig.1 Restriction enzyme analysis of transfer vector containing AAV2.A：pVL-Rep2酶切(BamHⅠ-XbaⅠ)；B：pVL-Cap2酶切(EcoRⅤ-EcoRⅠ)；C：pVL-Luc酶切(BamHⅠ-EcoRⅠ)；D：pVL-EGFP酶切(BamHⅠ-XbaⅠ)；M:DNA marker。

2.2 重組桿狀病毒的PCR鑒定

通過同源重組將目的片段cap2、rep2、EGFP和Luc克隆到家蠶桿狀病毒基因中，共轉染BmN細胞，分別獲得reBm-Cap2、reBm-Rep2、reBm-EGFP和reBm-Luc病毒液。如圖2所示，在2 900 bp、2 500 bp、730 bp和1 700 bp處擴增出了與目的片段大小一致的4個條帶，說明目的片段cap2、rep2、EGFP和Luc成功重組到病毒基因組中，并在家蠶中擴增。

圖2 重組桿狀病毒感染家蠶中目的基因PCR鑒定Fig.2 PCR identification of targeted genes in recombinant silkworm baculovirus.

2.3 家蠶中包裝的rAAV2的生物活性檢測

2.3.1家蠶中包裝的rAAV2-EGFP在HEK293T細胞中的EGFP表達效果 由圖3(彩圖見封三圖版)可以看出，感染reBm-EGFP的HEK293T細胞，無綠色熒光，說明reBm-EGFP在該純化過程中已被滅活，不可能產(chǎn)生熒光；感染rAAV2-Luc的HEK293T細胞和正常的HEK293T細胞都無綠色熒光，說明正常狀態(tài)的HEK293T細胞不會產(chǎn)生熒光，即使感染了攜帶熒光素酶基因的rAAV2也不會；而感染rAAV2-EGFP的HEK293T細胞有綠色熒光，說明在家蠶中包裝的rAAV2具有生物學活性，且在哺乳動物細胞中表達了EGFP，即表明成功用BmNPV-家蠶表達系統(tǒng)包裝了rAAV2。

2.3.2家蠶中包裝的rAAV2-Luc在HEK293T細胞中Luc表達量的測定 通過比對采用同樣方法純化的rAAV2-Luc和reBm-Luc感染的樣品中光量子強度的差別(圖4)，可以推斷出采用氯仿純化的方法可以滅活reBm-Luc，即表明成功用BmNPV-家蠶表達系統(tǒng)包裝了rAAV2。

3 討論

腺相關病毒是基因治療中常見的病毒載體，因其具有對人體無害的特性而被廣泛研究。AAV2是研究的最透徹的也是目前研究中最適于基因治療的血清型，目前生產(chǎn)的AAV大多是利用血清2型的rep、ITRs構建的假性載體。2型AAV對骨骼肌、神經(jīng)元、血管平滑肌和肝臟細胞等都有很好的轉染效果。研究還表明，AAV2能夠殺死癌細胞而不傷害正常細胞[20]。

圖3 正常HEK293T細胞及其感染純化rAAV2-EGFP、rAAV2-Luc、reBm-EGFP后的綠色熒光蛋白表達效果Fig.3 The green fluorescent protein expression of HEK293T cells and after infected with rAAV2-EGFP、rAAV2-Luc and reBm-EGFP.A：正常HEK293T細胞；B：感染rAAV2-EGFP的HEK293T細胞；C：感染rAAV2-Luc的HEK293T細胞；D：感染reBm-EGFP的HEK293T細胞。(彩圖見封三圖版)

圖4 正常HEK293T細胞(CK)及其感染純化rAAV2-Luc、reBm-Luc后的相對光量子強度Fig.4 Relative light unit of HEK293T cells (CK) and after infected with rAAV2-Luc and reBm-Luc.

目前，科研和實際應用中生產(chǎn)rAAV主要是通過非脊椎動物細胞(昆蟲細胞)獲得的，用AcMNPV-sf表達系統(tǒng)獲得rAAV需要3個重組AcMNPV 載體：rBac-Rep、rBac-Cap和rBac-ITR-GFP-ITR，這3個載體需要同時感染sf細胞用以包裝rAAV病毒，利用該方法包裝獲得的rAAV病毒量為104～105vg/cell。而本實驗使用的是BmNPV-家蠶表達系統(tǒng)，結果表明，利用家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)也可以實現(xiàn)rAAV2的包裝，且根據(jù)EGFP和Luc的表達結果，驗證了使用此方法包裝獲得的rAAV2具有感染哺乳動物細胞并驅(qū)動目的基因表達的能力。利用該表達系統(tǒng)，理論上在每毫升家蠶血淋巴和每克蠶蛹中的病毒基因組數(shù)目均能達到1012～1013vg，大大降低了rAAV的包裝成本，進而降低了臨床實驗和應用的成本，即其具有AcMNPV-sf表達系統(tǒng)的優(yōu)點同時表達量更高，且生產(chǎn)成本低幾百倍[21]。因此，用BmNPV-家蠶系統(tǒng)包裝rAAV也有可能獲得比昆蟲細胞高得多的產(chǎn)量，是一個比較理想的生產(chǎn)rAAV的系統(tǒng)。但與sf細胞相比，由于家蠶含有較多的非目的蛋白，所以其純化過程會更加繁瑣，即在實際操作中，使用氯仿純化的方法會降低rAAV表達量。

目前尚無利用家蠶表達系統(tǒng)包裝rAAV的相關報道。本次實驗證明了rAAV能夠在家蠶表達系統(tǒng)中表達，為后續(xù)用單家蠶桿狀病毒包裝rAAV，從而實現(xiàn)其大規(guī)模的生產(chǎn)，提供了理論基礎。但本研究中所用的三載體表達包裝策略的效率較單載體策略要低很多，且后續(xù)包裝操作方法較為繁瑣。2012年，Galibert等[22]開發(fā)出了單桿狀病毒包裝系統(tǒng)，將rep、cap基因和目的基因表達盒分別插入AcMNPV基因組的egt和polyhedrin基因等位點，構建一個重組桿狀病毒，這樣用一個重組病毒即可制備出rAAV載體。與三載體和雙載體體系相比，單載體策略的表達量顯著提高，是雙載體系統(tǒng)的6倍以上、三載體系統(tǒng)的60倍以上，且其穩(wěn)定性也有提高。以后研究使用家蠶桿狀病毒包裝rAAV時，可參考Galibert等[22]，用單家蠶桿狀病毒來包裝rAAV，從而獲得更高的包裝效率。

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